| Identification of Insertion Site by RESDA-PCR in Chlamydomonas Mutants Generated by AphVIII Random Insertional Mutagenesis
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] Chlamydomonas reinhardtii is frequently used as a model organism to study fundamental processes in photosynthesis, metabolism, and flagellar biology. Versatile tool boxes have been developed for this alga (Fuhrmann et al., 1999; Schroda et al., 2000; Schroda, 2006). Among them, forward genetic approach has been intensively used, mostly because of the high efficiency in the generation of hundreds of thousands of mutants by random insertional mutagenesis and the haploid nature therefore phenotypic analysis can be done in the first generation (Cagnon et al., 2013; Tunçay et al., 2013). A major bottleneck in the application of high throughput methods in a forward genetic approach is the identification of the genetic lesion(s) responsible for the ...
[摘要] 莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）是光合作用，代谢和鞭毛生物学的基础研究者。已经为这种藻类开发了多功能的工具箱（Fuhrmann等人，1999; Schroda等人，2000; Schroda，2006）。其中，正向遗传方法已经被广泛使用，主要是因为通过随机插入诱变产生了数十万个突变体的高效率，并且可以在第一代进行单倍体性质表型分析（Cagnon等人 2013，Tunçay et。 2013）。在正向遗传方法中应用高通量方法的主要瓶颈是鉴定与观察到的表型相关的遗传损伤。在该协议中，我们详细描述了最初在（González-Ballester等人，2005）中报道的限制性定点扩增PCR（RESDA-PCR）的改进版本。优化包括引物组合的优化，DNA聚合酶的选择，PCR循环参数的优化以及PCR产物直接测序的应用。这些修改使得获得特定的PCR产物变得更加容易，并且加速了亚克隆步骤以更快地获得测序数据。
【背景】除了限制酶位点定向扩增PCR（RESDA-PCR）（González-Ballester等人，2005）之外，还发现了其它几种分子技术。 包括Genome ...
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| Synthetic Lethality Screens Using RNAi in Combination with CRISPR-based Knockout in Drosophila Cells
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Author:
Date:
2017-02-05
[Abstract] A synthetic lethal interaction is a type of genetic interaction where the disruption of either of two genes individually has little effect but their combined disruption is lethal. Knowledge of synthetic lethal interactions can allow for elucidation of network structure and identification of candidate drug targets for human diseases such as cancer. In Drosophila, combinatorial gene disruption has been achieved previously by combining multiple RNAi reagents. Here we describe a protocol for high-throughput combinatorial gene disruption by combining CRISPR and RNAi. This approach previously resulted in the identification of highly reproducible and conserved synthetic lethal interactions (Housden et al., 2015).
[摘要] 合成的致死相互作用是一种遗传相互作用，其中两种基因之一的破坏单独具有影响，但它们的组合破坏是致命的。有关合成致死相互作用的知识可以帮助阐明网络结构和确定人类疾病如癌症的候选药物靶标。在果蝇中，组合基因破坏已经通过组合多个RNAi试剂而实现。这里我们通过组合CRISPR和RNAi来描述高通量组合基因破坏的协议。这种方法以前导致了高度可重现和保守的合成致死相互作用的识别（Housden等人，2015）。
背景 遗传相互作用的知识，如合成致死性，对于确定基因之间的功能关系可能是无价的。例如，酵母中的大规模遗传相互作用屏幕最近被用于组装全球“细胞功能的接线图”（Costanzo等人，2016）。或者，可以使用特定类型的遗传相互作用，例如合成致死相互作用来鉴定包括癌症在内的疾病的药物靶标（Kaelin，2005）。
＆nbsp;鉴定合成相互作用需要组合破坏两个基因。以前在果蝇细胞培养中实现该方法的方法是同时递送多个dsRNA试剂（例如，Fisher等人，2015）。然而，RNAi试剂具有局限性，包括脱靶效应和不完全靶标敲低，当多个试剂一起递送时，RNAi试剂复合。通过将CRISPR诱变与单个dsRNA处理相结合，可以避免这些问题，从而更简单地解释筛选结果并强化“点击”识别。
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| Whole Genome Bisulfite Sequencing and DNA Methylation Analysis from Plant Tissue
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Author:
Date:
2015-02-20
[Abstract] This protocol describes whole genome bisulfite-sequencing library preparation from plant tissue and subsequent data analysis. Allele-specific methylation analysis and genome-wide identification of differentially methylated regions are additional features of the analysis procedure.
[摘要] 该协议描述了植物组织的全基因组亚硫酸氢盐测序文库制备和随后的数据分析。 等位基因特异性甲基化分析和差异甲基化区域的全基因组鉴定是分析程序的附加特征。
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