| Generation of Luciferase-expressing Tumor Cell Lines
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Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract] Murine tumor models have been critical to advances in our knowledge of tumor physiology and for the development of effective tumor therapies. Essential to these studies is the ability to both track tumor development and quantify tumor burden in vivo. For this purpose, the introduction of genes that confer tumors with bioluminescent properties has been a critical advance for oncologic studies in rodents. Methods of introducing bioluminescent genes, such as firefly luciferase, by viral transduction has allowed for the production of tumor cell lines that can be followed in vivo longitudinally over long periods of time. Here we describe methods for the production of stable luciferase expressing tumor cell lines by lentiviral transduction.
[摘要] 鼠肿瘤模型对于我们对肿瘤生理学知识和有效肿瘤治疗方法发展的进展至关重要。 这些研究的关键是能够跟踪肿瘤发展并量化体内肿瘤负荷。 为此，引入赋予肿瘤生物发光特性的基因已经成为啮齿动物肿瘤研究的重要进展。 通过病毒转导引入生物发光基因（例如萤火虫萤光素酶）的方法已经允许产生可以在体内纵向长时间地进行的肿瘤细胞系。 在这里我们描述了通过慢病毒转导产生稳定表达荧光素酶的肿瘤细胞系的方法。
【背景】体内跟踪细胞最重要的是能够通过微创方法从外部检测它们。使用来自萤火虫的荧光素酶（Photinus pyralis ）的酶促生物发光是用于体内基于图像的细胞追踪的广泛使用的方法。生物发光已被用于各种体内应用，包括报告基因表达的无创成像（Herschman，2004），研究昼夜节律（Southern and Millar，2005），成像脑卒中（Vandeputte
萤火虫荧光素酶氧化物萤光素在分子氧，镁和三磷酸腺苷存在下在560nm产生黄绿色光（Wilson和Hastings，1998; ...
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| Macrophage Phagocytosis Assay of Staphylococcus aureus by Flow Cytometry
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2015-02-20
[Abstract] This protocol describes a straightforward technique to evaluate the phagocytotic capacity of murine macrophages for Staphylococcus aureus (S. aureus). By staining S. aureus with Hexidium Iodide and staining murine bone marrow-derived macrophages (BMDMs) with FITC, the macrophage bacterial up-taking ability can be rapidly analyzed by flow cytometry. S. aureus is a Gram-positive bacteria causing severe human and animal infections. Host immune cells such as macrophages serve to eliminate S. aureus by phagocytosing the pathogen and save the host from life-threatening diseases. Study of host macrophage ability to phagocytose S. aureus is important for understanding the host-pathogen interaction and can help to elucidate the pathogenesis of S. ...
[摘要] 该协议描述了评估小鼠巨噬细胞对金黄色葡萄球菌（金黄色葡萄球菌）的吞噬能力的直接技术。 通过染色。 金黄色葡萄球菌与碘化己锭染色并用FITC染色鼠骨髓衍生的巨噬细胞（BMDM），可以通过流式细胞术快速分析巨噬细胞细菌摄取能力。 aureus 是一种革兰氏阳性菌，引起严重的人类和动物感染。 宿主免疫细胞例如巨噬细胞用于消除S。 金黄色葡萄球菌通过吞噬病原体并将宿主从危及生命的疾病中拯救。 宿主巨噬细胞吞噬能力的研究。 金黄色葡萄球菌对于理解宿主 - 病原体相互作用是重要的，并且可以帮助阐明S的发病机制。 aureus 感染。 该方案也可应用于其他革兰氏阳性菌的巨噬细胞吞噬测定。
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| Phagolysosomal Trafficking Assay
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Author:
Date:
2014-07-05
[Abstract] Phagolysosomal trafficking is an important innate defense pathway that clears microbes by delivering them to lysosomes, the degradative compartment of the cell. Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis, subverts this host defense mechanism by arresting maturation of the phagosome. The ability of Mtb to arrest its delivery to the lysosome can be demonstrated by the prolonged co-localization of bacteria containing phagosomes/vacuole with early phagosomal markers [such as, Ras- related proteins in the brain 5 (Rab5) and Transferrin receptor (TfR)], and a failure to acquire late phagosomal and lysosomal markers (such as Rab7 and LAMP1) (Deretic and Fratti, 1999, Mehra et al., 2013). Here, a protocol is outlined for infection of macrophages with ...
[摘要] 吞噬溶酶体运输是重要的先天防御途径，通过将其递送至溶酶体，即细胞的降解区室来清除微生物。结核病的致病因子结核分枝杆菌（Mtb）通过阻滞吞噬体的成熟来破坏这种宿主防御机制。 Mtb阻止其递送至溶酶体的能力可以通过含有吞噬体/液泡的细菌与早期吞噬体标记物[例如，脑5中的Ras相关蛋白（Rab5）和转铁蛋白受体（TfR） ）]，以及未获得晚期吞噬体和溶酶体标记物（例如Rab7和LAMP1）（Deretic和Fratti，1999，Mehra等人，2013）。在这里，概述了用分枝杆菌物种感染巨噬细胞的方案，所述分枝杆菌物种如致病性Mtb疫苗菌株牛分枝杆菌 - 卡介苗（BCG）和快速分裂的非致病性耻垢分枝杆菌（Msmeg），然后间接免疫荧光显微镜观察宿主液泡标记。此后，通过使用数学工具处理细菌的二值图像来进行分枝杆菌和宿主液泡标记如TfR和LAMP1之间的共定位程度的自动定量。这导致直接在细菌/细菌簇周围的这些宿主标志物的平均荧光强度（MFI）的定量，相对于手动完成时具有增加的灵敏度。通过操纵宿主或病原体，该测定可用于评价细胞内运输的宿主或细菌决定簇。基本方法可以应用于研究其他细菌或颗粒状珠子的运输，尽管感染和吞噬体成熟的动力学将取决于吞噬性货物。数学分析工具可用于许多标准成像分析程序。然而，对于类似分析的任何适应性应由个体用户利用其成像和分析平台来确认。
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