| Determination of Flavin Potential in Proteins by Xanthine/Xanthine Oxidase Method
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Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] This protocol describes a simple xanthine/xanthine oxidase enzymatic equilibration method for determination of the redox potential of a flavin. As an example of the use of this method, we determine the reduction potential of the covalently bound FAD cofactor (Em = -55 mV) in the SdhA flavoprotein subunit of succinate dehydrogenase from Escherichia coli. In principle, this method can be used routinely to determine the redox potential of flavin cofactors in any simple flavoprotein from equilibrium concentrations with an appropriate reference dye of known Em without the use of sophisticated electrochemical equipment.
[摘要] [摘要] 该协议描述了一种简单的黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶酶平衡方法，用于测定黄素的氧化还原电位。作为使用此方法的一个例子，我们确定了大肠杆菌中琥珀酸脱氢酶的SdhA 黄素亚基中共价结合的FAD辅因子的还原电位（E m = -55 mV）。原则上，该方法可常规用于通过平衡浓度和已知E m 的适当参考染料确定任何简单黄素蛋白中黄素辅因子的氧化还原电位。 无需使用复杂的电化学设备。
[背景] 几种生物物理方法可用于测量蛋白质中黄素的还原中点电位（E m ）。这些电位测量方法通常依赖于目标蛋白质和电极之间的电化学偶联。例如，在带有其他辅助因子（例如铁硫中心和醌）的复杂黄素蛋白中，常常使用电化学方法和电子顺磁共振（EPR）光谱来确定氧化还原中心的E m （Kowal 等，1995；Saenger等，等人，2005； Hudson 等人，2005； Cheng 等人，2015）。然而，在只包含黄素氧化还原中心简单黄素蛋白，辅助因子，可以直接通过它不需要特殊的设备电化学或昂贵的EPR仪表传统光学分光光度法研究。1990年，文森特·梅西（Vincent Massey）提出了一种简单的方法，该方法可以从氧化和还原伴侣（即黄素蛋白和参考染料）的平衡浓度中确定黄素的还原电位（Massey，1991）。该方法不直接测量黄素的还原电势，而是确定黄素和参考染料的E m ...
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| Induction of Natural Competence in Genetically-modified Lactococcus lactis
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Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] Natural competence can be activated in Lactoccocus lactis subsp lactis and cremoris upon overexpression of ComX, a master regulator of bacterial competence. Herein, we demonstrate a method to activate bacterial competence by regulating the expression of the comX gene by using a nisin-inducible promoter in an L. lactis strain harboring either a chromosomal or plasmid-encoded copy of nisRK. Addition of moderate concentrations of the inducer nisin resulted in concomitant moderate levels of ComX, which led to an optimal transformation rate (1.0 x 10-6 transformants/total cell number/g plasmid DNA). Here, a detailed description of the optimized protocol for competence induction is presented.
[摘要] 在过度表达细菌能力的主要调节因子ComX后，天然能力可以在乳酸乳球菌亚种乳酸和 cremoris 中激活。 在本文中，我们展示了通过在 L中使用乳链菌肽诱导型启动子调节 comX 基因的表达来激活细菌能力的方法。 含有 nisRK 的染色体或质粒编码拷贝的lactis 菌株。 加入中等浓度的诱导剂乳链菌肽导致伴随的中等水平的ComX，其导致最佳转化率（1.0×10 2 sup / -6>转化子/总细胞数/ g质粒DNA）。 在此，提出了用于能力归纳的优化协议的详细描述。
【背景】自然能力是细菌通过专门的摄取机制获得外源DNA的过程，之后内化的DNA整合到其基因组中或作为质粒DNA维持。一些细菌在特定的环境触发因素如基因毒性应激或饥饿时进入能力状态（Seitz和Blokesch，2013; Blokesch，2016）。群体感应系统，如 comCDE 或 comRS ，控制着革兰氏阳性菌的自然能力的激活（Håvarstein et al。，1995; Pestova et al。，1996; Kleerebezem et al。，1997b; Fontaine et al。，2015）。更具体地说， comC 和 comS 编码信息素，而 comD 编码组氨酸激酶和 comE 和 comR 编码响应调节器（Håvarstein et al。，1995; ...
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| Quantification of Uric Acid or Xanthine in Plant Samples
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Author:
Date:
2015-07-05
[Abstract] We developed this protocol to assay and quantify the content of uric acid or xanthine in various tissues of Arabidopsis thaliana mutant lines with defective urate oxidase or xanthine dehydrogenase1 and in their complementation and suppressor lines (Hauck et al., 2014).
The protocol is based on a method developed by Invitrogen Life Technologies for measuring uric acid or xanthine in human serum (see References 2 and 3). That protocol though required two adaptions for its use in plant science. Firstly by heating the plant samples, the activity of urate oxidase and xanthine dehydrogenase in the wild type samples is eliminated. Wild type extracts always serve as the proper pigmentation background when calculating the standard curves of uric acid and xanthine. ...
[摘要] 我们开发了该方案以测定和定量具有缺陷的尿酸氧化酶或黄嘌呤脱氢酶1的拟南芥突变体系以及它们的互补和抑制系的各种组织中的尿酸或黄嘌呤的含量（Hauck等</em>，2014）。
该方案基于由Invitrogen Life Technologies开发的用于测量人血清中的尿酸或黄嘌呤的方法（参见参考文献2和3）。该协议虽然需要两个适应它在植物科学中的使用。首先通过加热植物样品，消除野生型样品中的尿酸氧化酶和黄嘌呤脱氢酶的活性。当计算尿酸和黄嘌呤的标准曲线时，野生型提取物总是作为适当的色素沉着背景。其次，在添加和不添加尿酸氧化酶或黄嘌呤脱氢酶的情况下测量所有样品，以校正由先前应激诱导的样品中的任何H 2 O 2 O 2。 >该测定基于以下一对偶联反应：</1> 1）尿酸+ O 2→羟基香草酸+ H 2 O 2 - （辣根过氧化物酶反应）的反应物（尿酸氧化酶反应）的反应。 ）
因此对于黄嘌呤：
1）黄嘌呤+ H 2 O + O 2→尿酸+ H 2 - O 2（黄嘌呤氧化酶反应）2→AR + H 2→O→2→Resorufin + O 2→ （辣根过氧化物酶反应）
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