| NP-40 Fractionation and Nucleic Acid Extraction in Mammalian Cells
|
|
Author:
Date:
2017-10-20
[Abstract] This technique allows for efficient, highly purified cytoplasmic and nuclear-associated compartment fractionation utilizing NP-40 detergent in mammalian cells. The nuclear membrane is not disturbed during the fractionation thus leaving all nuclear and perinuclear associated components in the nuclear fraction. This protocol has been modified from Sambrook and Russell (2001) in order to downscale the amount of cells needed. To determine the efficiency of fractionation, we recommend using qPCR to compare the subcellular compartments that have been purified with equivalent amount of control whole cell extracts.
[摘要] 该技术允许在哺乳动物细胞中利用NP-40洗涤剂进行高效，高度纯化的细胞质和核相关的分室分离。 在分离过程中核膜不受干扰，从而使核部分中的所有核和核周相关成分留下。 该协议已经从Sambrook和Russell（2001）修改，以便缩减所需的细胞数量。 为了确定分馏的效率，我们建议使用qPCR来比较已经用等量的对照全细胞提取物纯化的亚细胞室。
【背景】为了充分获得对细胞过程的理解，需要分离核和细胞质隔室。 有许多协议，甚至一些商业套件可用于帮助分离两个隔间。 然而，大多数需要高离心速度，产量差异甚至验证最终产品中的污染物量的方法也是很高的。 我们的协议在低速下使用小型台式离心机，以获得高纯度的细胞质提取物和核/核周组合相关隔室，以及数据分析，以验证污染物的百分比。 迄今为止，已经测试的细胞系是293T，HeLa和GHOST细胞系。 （Galvis，2014; Galvis等，，2014）。
|
|
|
| Drosophila Fecal Sampling
|
|
Author:
Date:
2017-09-20
[Abstract] Fecal sampling is a non-invasive method which raises the possibility to study the development and the changes in the microbial community throughout different time points of a fly population or throughout different treatments. This method allows precise manipulation to trigger the fly’s physiology by nutritional interventions, bacterial infections or other stressors.
As in most other animals, the intestinal microbiota is essential for a healthy fly-life. Because Drosophila only harbors a relative simple bacterial community with a small variety of round about 8 to 10 different species, it is rather easy to build up the microbial community and to investigate microbial changes after treatment.
Another positive effect using the fly’s feces is that bacteria that ...
[摘要] 粪便取样是一种非侵入性方法，提高了在飞行群体的不同时间点或整个不同处理过程中研究微生物群落的发展和变化的可能性。这种方法允许精确的操纵通过营养干预，细菌感染或其他压力源触发苍蝇的生理学。
与大多数其他动物一样，肠道微生物群对健康的飞行生命至关重要。因为果蝇只拥有一个相对简单的细菌群落，有大约8到10个不同种类的小种，很容易建立微生物群落，并在处理后调查微生物的变化。
使用蝇的粪便的另一个积极作用是不是肠微生物群的一部分的细菌，例如Wolbachia，可以直接从分析中排除，因为它们不会排泄。
使用这种方法，生成的数据集可能反映了在简单飞行模型中研究微生物组织相关疾病的一个很好的范例，此外，可以以高通量方法测试药物。
|
|
|
| Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Assay for Detecting Direct and Indirect Protein – DNA Interactions in Magnaporthe oryzae
|
|
Author:
Date:
2015-11-05
[Abstract] Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful technology for analyzing protein-DNA interactions in cells. Robust ChIP procedures have been established for investigating direct interactions between protein and DNA. However, detecting indirect protein-DNA interactions in vivo is challenging. Recently, we used ChIP to analyze an indirect protein-DNA interaction between a putative histone demethylase, MoJmjC, and the promoter of the superoxide dismutase 1-encoding gene MoSOD1 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae (M. oryzae) (Fernandez et al., 2014). We tagged MoJmjC with the 3x FLAG epitope (Fernandez et al., 2014), instead of the larger and more commonly used GFP epitope, to mitigate against steric hindrance. We also employed ...
[摘要] 染色质免疫沉淀（ChIP）是一种强大的技术，用于分析细胞中的蛋白质-DNA相互作用。已建立了稳健的ChIP程序用于研究蛋白质和DNA之间的直接相互作用。然而，在体内检测间接蛋白-DNA相互作用是具有挑战性的。最近，我们使用ChIP来分析推定的组蛋白去甲基化酶MoJmjC和在稻瘟病真菌Magnaporthe oryzae中超氧化物歧化酶1编码基因MoSOD1的启动子之间的间接蛋白质-DNA相互作用（ oryzae ）（Fernandez ，，2014）。我们用3x FLAG表位标记MoJmjC（Fernandez等人，2014），而不是更大和更常用的GFP表位，以减轻空间位阻。我们还采用了使用DSG和甲醛的两步交联策略，而不是更常用于分析直接蛋白质-DNA相互作用的一步甲醛交联方法，以便更好地捕获间接的MoJm - MoSOD1 DNA相互作用。此外，我们已经表明两步交联适用于GATA转录因子，Asd4及其同源结合位点之间的直接蛋白-DNA相互作用的ChIP分析（Marroquin-Guzman和Wilson，2015）。在这里，我们提供详细的协议的染色质免疫沉淀，与通用的两步交联，在M。 oryzae 。
|
|
|