| Serial Immunoprecipitation of 3xFLAG/V5-tagged Yeast Proteins to Identify Specific Interactions with Chaperone Proteins
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] This method was generated to isolate high affinity protein complexes from yeast lysate by performing serial affinity purification of doubly tagged 3xFLAG/V5 proteins. First, the bait protein of interest is immunoprecipitated by anti-FLAG-conjugated magnetic beads and gently eluted by 3xFLAG antigen peptide. Next, the bait protein is recaptured from the first eluate by anti-V5-conjugated magnetic beads and eluted with ionic detergent. In this manner, the majority of abundant, nonspecific proteins remain either bound to the first beads or in the first eluate, allowing pure, high affinity complexes to be obtained. This approach can be used to show specific interactions with notoriously ‘sticky’ chaperone proteins.
[摘要] 产生这种方法通过双重标记的3xFLAG / V5蛋白的连续亲和纯化来分离来自酵母裂解物的高亲和力蛋白质复合物。 首先，感兴趣的诱饵蛋白通过抗FLAG缀合的磁珠免疫沉淀，并用3xFLAG抗原肽轻轻洗脱。 接下来，通过抗V5共轭磁珠从第一洗脱液中回收诱饵蛋白质并用离子型洗涤剂洗脱。 以这种方式，大多数丰富的非特异性蛋白质仍然与第一珠粒或第一洗脱液结合，从而获得纯的高亲和性复合物。 这种方法可用于显示与臭名昭着的“粘滞”伴侣蛋白的特定相互作用。
【背景】通过质谱（IP / MS）进行免疫沉淀是鉴定与特定目标诱饵蛋白质的蛋白质 - 蛋白质相互作用的无偏见方法。虽然这种方法被有效地应用于鉴定蛋白质相互作用网络，但是它被假阳性困扰 - ...
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| Gliding Assay to Analyze Microtubule-based Motor Protein Dynamics
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] The purpose of this protocol is to provide an updated method of performing microtubule gliding assays and visualizing it using fluorescence microscopy.
[摘要] 该协议的目的是提供一种更新的微管滑翔测定方法，并使用荧光显微镜对其进行可视化。
有丝分裂主轴是主导有丝分裂的蛋白质机械。有丝分裂纺锤体利用基于微管的运动蛋白来组织自身，并施加力量驱动细胞分裂。基于微管的运动蛋白使用源自ATP水解的能量产生机械工作（Coppin等人，1997）。运动蛋白以单向方式转移微管。运动的行为可以通过体外滑行测定（Tao和Scholey，2010）来观察，其中将电机固定在玻璃表面上并提供微管和ATP。然后可以使用荧光显微镜研究运动蛋白的运动性，并且可以实时观察其动态行为的细节。该更新的方案将允许使用体外微管滑动测定法（Tao等人，2006和2016）分析基于微管的运动蛋白功能。
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| In vitro Microtubule Bundling Assay under Physiological Conditions
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] Kinesins play a role in organizing the mitotic spindle through the crosslinking of microtubules (MTs), made possible through binding sites at opposite ends of the holoenzyme. Here, we developed a method to test kinesin MT crosslinking action under physiological conditions.
[摘要] 驱动蛋白通过微管（MT）的交联来组织有丝分裂纺锤体，通过在全酶的相对端的结合位点成为可能。在这里，我们开发了一种在生理条件下测试驱动蛋白MT交联作用的方法。
基于微管的运动蛋白是重要的，因为它们使用ATP的化学能产生力以便向量转移微管（MT）。在这些基于MT的运动蛋白中，称为驱动蛋白的超家族负责定向运输和沿微管的运动。一些运动蛋白在全酶的两端具有MT结合位点，因此它们可以在生理ATP条件下将MT交联成束（Tao等人，2006）。由于这种捆绑活动，它们在组织和维持有丝分裂纺锤体方面具有重要作用，其主要作用取决于其微管的极性模式（van den Wildenberg等人，2008）。以前的捆绑测定不包括ATP，或者使用可以产生人为结果的不可水解的ATP类似物。这里我们开发了一种使用生理ATP条件的方法。通过纯化这些全长运动蛋白，它使我们能够在生理条件下测定其交联活性。
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