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Author:
Date:
2014-11-05
[Abstract] Secondary active transport of substrates across the inner membrane is vital to the bacterial cell. Of the secondary active transporter families, the ubiquitous major facilitator superfamily (MFS) is the largest and most functionally diverse (Reddy et al., 2012). Recently, it was reported that the MFS multidrug efflux protein MdtM from Escherichia coli (E. coli) functions physiologically in protection of bacterial cells against bile salts (Paul et al., 2014). The MdtM transporter imparts bile salt resistance to the bacterial cell by coupling the exchange of external protons (H+) to the efflux of bile salts from the cell interior via an antiport reaction. This protocol describes, using fluorometry, how to detect the bile salt/H+ ...
[摘要] 底物穿过内膜的二次主动转运对细菌细胞是至关重要的。在次要活性转运蛋白家族中，遍在的主要促进子超家族（MFS）是最大和最功能多样的（Reddy等人，2012）。最近，据报道，来自大肠杆菌（大肠杆菌）的MFS多药物外排蛋白MdtM在保护细菌细胞对抗胆汁盐中具有生理功能（Paul等人al。，2014）。 MdtM转运蛋白通过将外部质子（H + +）的交换耦合到通过反向端反应从细胞内部排出的胆汁盐，赋予细菌细胞以抗胆汁盐性。该方案使用荧光测定法描述了如何在E的逆向转运体缺陷菌株的倒置膜囊泡中检测MdtM的胆汁盐/H sup/+抗末端活性。通过测量跨膜ΔpH测定大肠杆菌 TO114细胞。该方法利用pH敏感染料吖啶橙的荧光信号（淬灭和去淬灭）的强度响应于囊泡腔中的[H sup +]的变化而发生的变化。由于内源性转运蛋白表达的低水平，其通常使得单个转运蛋白例如MdtM对质子驱动的反运输蛋白的贡献难以检测，所述方法通常需要从多拷贝质粒过表达所关注的转运蛋白。尽管本文所述的方案的第一部分对于来自pBAD/emyc-His-A表达载体的MdtM的过表达非常特异，但描述随后通过MdtM测量胆汁盐流出的方案可以容易地适用于通过任何其他反交换器测量其它底物的反向运输，其交换质子用于对衬底。
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