| Expression and Purification of a Mammalian P2X7 Receptor from Sf9 Insect Cells
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] The P2X7 receptor is an extracellular ATP-gated ion channel found only in eukaryotes (Bartlett et al., 2014). Due to its unique properties among P2X receptors, such as formation of a large conductance pore, the P2X7 receptor has been implicated in devastating diseases like chronic pain (North and Jarvis, 2013). However, mechanisms underlying the P2X7 specific properties remain poorly understood, partly because purification of this eukaryotic membrane protein has been challenging. Here we describe a detailed protocol for expressing and purifying a mammalian P2X7 receptor using an insect cell-baculovirus system. The P2X7 receptor is expressed in Sf9 insect cells as a GFP fusion protein and solubilized with a buffer containing Triton X-100 detergent. The P2X7-GFP fusion protein is ...
[摘要] P2X7受体是仅在真核生物中发现的胞外ATP门控离子通道（Bartlett等，2014）。由于其P2X受体之间的独特性质，例如大电导孔的形成，P2X7受体已经涉及破坏性疾病如慢性疼痛（North和Jarvis，2013）。然而，P2X7特异性属性的机制仍然知之甚少，部分原因是纯化这种真核膜蛋白是一个挑战。在这里，我们描述了使用昆虫细胞 - 杆状病毒系统表达和纯化哺乳动物P2X7受体的详细方案。 P2X7受体在作为GFP融合蛋白的Sf9昆虫细胞中表达，并用含有Triton X-100洗涤剂的缓冲液溶解。然后使用Strep-Tactin亲和层析在含有十二烷基麦芽糖苷的缓冲液中纯化P2X7-GFP融合蛋白。在通过凝血酶酶切割连接的GFP和Strep-标签后，使用大小排阻色谱分离P2X7受体。该方法通常从6L的Sf9培养物产生约2mg的纯化蛋白质。纯化的蛋白质可以用含有15％甘油的缓冲液在4℃下储存至少2个月，并用于各种功能和结构研究（Karasawa和Kawate，2016）。
【背景】P2X7受体是嘌呤能P2X受体家族的七种亚型之一，并且是广泛疾病如神经退行性疾病，癫痫和神经性疼痛的有希望的新型药物靶点（North和Jarvis，2013; Bhattacharya和Biber， ...
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| Rapid Isolation of Total Protein from Arabidopsis Pollen
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Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] Arabidopsis pollen is an excellent system for answering important biological questions about the establishment and maintenance of cellular polarity and polar cell growth, because these processes are amenable to the genetic and genomic approaches that are readily available in Arabidopsis. Given that proteins are the direct executors of a wide variety of cellular processes, it is important to rapidly and efficiently isolate total protein for various protein-based analyses, such as Western blotting, co-immunoprecipitation and mass spectrometry, among others. Here we present a protocol for rapid isolation of total protein from Arabidopsis pollen, which is adapted from our recently published paper (Chang and Huang, 2015).
[摘要] 拟南芥花粉是用于回答关于细胞极性和极性细胞生长的建立和维持的重要生物学问题的优秀系统，因为这些方法适用于在中容易获得的遗传和基因组方法， 拟南芥。 鉴于蛋白质是各种细胞过程的直接执行者，重要的是快速有效地分离各种基于蛋白质的分析的总蛋白质，例如Western印迹，共免疫沉淀和质谱等。 在这里，我们提出了一种从拟南芥花粉中快速分离总蛋白的方案，该方法是从我们最近发表的论文（Chang and Huang，2015）中得到改编的。
花粉是性繁殖植物生命周期的关键阶段。花粉萌发和随后的管生长提供了两个非活动精子细胞在开花植物中进行双重受精的通道。花粉通常被用作解决基本细胞生物学问题的示范系统，例如细胞极性和极细胞生长的建立和维持，以及肌动蛋白细胞骨架的结构和功能（Chen等人， ，2009; Qu等人，2015）。通常来自百合和烟草的花粉由于粒度大而被广泛使用，这使得它们在显微镜下容易收集和观察。相比之下，拟南芥花粉小，收集大量花粉以分离足够量的蛋白质以进行下游分析（如Western印迹和质谱法）相对困难。因此，开发快速分离总拟蛋白质拟南芥花粉的方案将有助于相关分析。
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| Analyses of Root-secreted Acid Phosphatase Activity in Arabidopsis
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] Induction and secretion of acid phosphatase (APase) is a universal adaptive response of higher plants to low-phosphate stress (Tran et al., 2010). The intracellular APases are likely involved in the remobilization and recycling of phosphate (Pi) from intracellular Pi reserves, whereas the extracellular or secreted APases are believed to release Pi from organophosphate compounds in the rhizosphere. The phosphate starvation-induced secreted APases can be released into the rhizosphere or retained on root surfaces (root-associated APases). In this article, we describe the protocols for analyzing root-secreted APase activity in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis). In Arabidopsis, the activity of both root-associated APases and APases that are ...
[摘要] 酸性磷酸酶（APase）的诱导和分泌是高等植物对低磷酸盐胁迫的普遍适应性反应（Tran et al。，2010）。细胞内APase可能参与磷酸盐（Pi）从细胞内Pi储备的再利用和再循环，而细胞外或分泌的APase被认为从根际中的有机磷酸盐化合物中释放出Pi。磷酸盐饥饿诱导的分泌的APase可以释放到根际中或保留在根表面（根相关的APase）上。在本文中，我们描述了在拟南芥（Arabidopsis thaliana）（拟南芥）中分析根分泌的APase活性的方案。在拟南芥中，释放到根际的根系相关APase和APase的活性可以基于它们切割合成底物，释放黄色产物的对硝基苯基磷酸（pNPP）的能力来定量，对硝基苯酚（pNP）（Wang等，2011和2104）。根系相关的APase活性也可以通过将显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基 - 磷酸酯（BCIP）施用到根表面来直接显现（Lloyd等人，2001; Tomscha et al。 ，2004; Wang等人，2011和2014），而释放到根际中的APase的同功酶可以使用凝胶内测定法（Trull和Deikman，1998; Tomscha等人，2004; Wang等人， 2011年和2014年）。之前已经描述了用于分析拟南芥细胞内APase活性的方案（Vicki和William，2013）。
【背景】磷酸盐（Pi）是植物通过根系发生磷的主要形式，大多数土壤中的Pi水平较低，导致Pi饿。为了应对这种营养压力，植物引发了一系列适应性反应，增加了其生存和增长。 ...
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