| In vitro Analysis of Ubiquitin-like Protein Modification in Archaea
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Author:
Date:
2018-05-20
[Abstract] The ubiquitin-like (Ubl) protein is widely distributed in Archaea and involved in many cellular pathways. A well-established method to reconstitute archaeal Ubl protein conjugation in vitro is important to better understand the process of archaeal Ubl protein modification. This protocol describes the in vitro reconstitution of Ubl protein modification and following analysis of this modification in Haloferax volcanii, a halophilic archaeon serving as the model organism.
[摘要] 泛素样（Ubl）蛋白广泛分布于古细菌中并参与许多细胞途径。 为了更好地理解古细菌Ub1蛋白质修饰的过程，重建体外古细菌Ubl蛋白质缀合物的完善方法是很重要的。 该协议描述了Ubl蛋白质修饰的体外重建以及在作为模型生物的嗜盐古细菌Haloferax volcanii 中对这种修饰进行分析。
【背景】泛素（Ub）与靶蛋白共价连接的过程被称为泛素化，其控制真核细胞中大量的细胞过程（Glickman和Ciechanover，2002; Komander和Rape，2012）。遍在蛋白化由一系列酶（包括Ub激活酶（E1），Ub结合酶（E2s）和Ub连接酶（E3s））催化。泛素化的体外重建是确定酶之间或E3与蛋白质底物之间特异性的有用测定法（Zhao等人，2012）。在古细菌中，Ubl蛋白SAMP采用Ub折叠，并且与E1样酶UbaA催化的蛋白靶标异肽连接[Maupin-Furlow，（2014）综述]。尽管E1同系物在古细菌中广泛存在，但基于一级序列比较，在大多数古细菌中未预测经典E2或E3酶。我们最近对Haloferax volcanii的研究表明甲硫氨酸亚砜还原酶A（MsrA）是Ubl蛋白质修饰（sampylation）与UbaA一起在体内温和的氧化条件下和< （体外）（fu="">
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| Isolation and Separation of Epithelial CD34+ Cancer Stem Cells from Tgfbr2-deficient Squamous Cell Carcinoma
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] Most epithelial tumors have been shown to contain cancer stem cells that are potentially the driving force in tumor progression and metastasis (Kreso and Dick, 2014; Nassar and Blanpain, 2016). To study these cells in depth, cell isolation strategies relying on cell surface markers or fluorescent reporters are essential, and the isolation strategies must preserve their viability. The ability to isolate different populations of cells from the bulk of the tumor will continue to deepen our understanding of the biology of cancer stem cells. Here, we report the strategy combining mechanical tumor dissociation, enzymatic treatment and flow cytometry to isolate a pure population of epithelial cancer stem cells from their native microenvironment. This technique can be useful to further ...
[摘要] 大多数上皮肿瘤已经显示含有可能是肿瘤进展和转移的驱动力的癌症干细胞（Kreso和Dick，2014; Nassar和Blanpain，2016）。 为了深入研究这些细胞，依赖于细胞表面标志物或荧光报告基因的细胞分离策略是必不可少的，分离策略必须保持其活力。 从大部分肿瘤中分离不同细胞群的能力将继续加深我们对癌症干细胞生物学的认识。 在这里，我们报告了结合机械肿瘤解离，酶处理和流式细胞术的策略，从其天然微环境中分离出纯种群的上皮癌干细胞。 该技术可用于进一步功能性地分析癌症干细胞（RNA测序和表观遗传学分析），在培养物中培养它们或在移植测定中直接使用它们。
【背景】肿瘤复发和转移是大多数与癌症有关的死亡的主要原因。恶性肿瘤可能由干细胞群体启动和维持（Nassar和Blanpain，2016; Bonnet和Dick，1997），这些细胞是预防复发的重要治疗靶点（Baumann et al。，2008）。研究表明，鳞状细胞癌由肿瘤干细胞亚群维持，其抗药性，并通过进行自我更新和分化（如正常干细胞）引发肿瘤复发，产生增殖祖细胞，其分化形成肿瘤大部分（Locke et al。，2005; Prince et al。，2007; Malanchi et al。，2008; de Sousa e Melo et ...
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| Antisense Oligonucleotide-mediated Knockdown in Mammary Tumor Organoids
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Author:
Date:
2017-08-20
[Abstract] Primary mammary tumor organoids grown in 3D are an excellent system to study tumor biology. They resemble the organization and physiology of native epithelia more closely than cancer cell lines grown in 2D, and additionally model interactions with the ECM (Boj et al., 2015; Clevers, 2016; Shamir and Ewald, 2014). Mammary tumor organoids are therefore a promising model system to identify and characterize novel drivers of breast cancer that would be unlikely to be identified using 2D cell lines. Antisense oligonucleotides can be used to efficiently and specifically knockdown target genes in the cell (Bennett et al., 2017). They can be taken up freely by organoids without the need for a transfection agent, making them a convenient tool for routine lab studies and screens.
[摘要] 在3D生长的原发性乳腺肿瘤组织是研究肿瘤生物学的优秀系统。 它们类似于天然上皮的组织和生理学，比2D生长的癌细胞系更为紧密，另外还与ECM的模型相互作用（Boj et al。，2015; Clevers，2016; Shamir and Ewald，2014）。 因此，乳腺肿瘤组织因子是一种有希望的模型系统，用于识别和表征不可能使用2D细胞系识别的乳腺癌的新型驱动因素。 反义寡核苷酸可用于有效和特异地敲低细胞中的靶基因（Bennett等，2017）。 它们可以被有机物自由摄取，而不需要转染剂，使其成为常规实验室研究和筛选的便捷工具。
【背景】乳腺癌是全世界妇女中最常见的恶性肿瘤，是妇女癌症死亡率的第二大原因（Siegel等，2017）。为了改善现有的治疗方案，确定和调查具有预防乳腺癌进展潜力的新分子靶标至关重要。我们应用RNA-seq来产生与正常乳腺上皮细胞相比在原发性乳腺肿瘤中失调的长非编码RNA（lncRNA）的综合目录，并将30个先前未表征的lncRNA作为乳腺肿瘤相关RNA（MaTARs）进行优先排序。为了功能评估MaTARs作为肿瘤进展的关键驱动因素，我们对3D乳腺肿瘤组织中的所有30个MaTARs进行了反义寡核苷酸（ASO）介导的敲低分析（Diermeier等，2016）。
ASO是短（20-mers），含有硫代磷酸酯修饰的核苷酸的单链DNA分子以及2'-ribose（5-10-5 ...
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