| Quantification of Starch in Guard Cells of Arabidopsis thaliana
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Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] In this protocol, we describe how to quantify starch in guard cells of Arabidopsis thaliana using the fluorophore propidium iodide and confocal laser scanning microscopy. This simple method enables monitoring, with unprecedented resolution, the dynamics of starch in guard cells.
[摘要] 在该方案中，我们描述了如何使用荧光团碘化丙啶和共聚焦激光扫描显微镜来量化拟南芥保卫细胞中的淀粉。 这种简单的方法能够以前所未有的分辨率监测保卫细胞中淀粉的动态变化。
【背景】淀粉是葡萄糖的复合聚合物，代表植物储存碳水化合物的最丰富形式。淀粉根据其衍生的细胞类型和外部环境条件提供不同的功能。在控制水和二氧化碳与环境交换的气孔中边界的保卫细胞中，淀粉可在转变为光的几分钟内动员，有助于产生有机酸和糖，从而增加保卫细胞膨胀并促进气孔开放。在叶肉细胞中，淀粉通常在白天逐渐积累，并在夜间降解以支持代谢（Santelia和Lunn，2017）。
因为保卫细胞仅占总叶的一小部分，所以难以使用常规方法定量测量淀粉。到目前为止，保卫细胞中的淀粉积累主要通过碘染色显现。该技术可以确定淀粉的存在/不存在，但不能提供准确的定量信息。
在这里，我们描述了一种基于荧光的成像方法来量化拟南芥保护细胞中的淀粉。该技术基于细胞壁材料和其他葡聚糖底物（包括淀粉）与荧光假席夫试剂碘化丙啶（PS-PI）的共价标记。用高碘酸处理分离的表皮，以将葡萄糖单元的羟基氧化成醛和酮基团。然后醛基（-CHO）可以与碘化丙锭共价反应，产生具有高荧光葡聚糖的样品，非常适合于共聚焦激光扫描显微镜。保卫细胞叶绿体中单个淀粉颗粒的面积可以使用数字成像来确定。我们应用这种方法来评估完整的拟南芥叶片的保护细胞中的淀粉含量在昼夜循环中的动态变化，并确定fusicoccin（质子泵的化学活化剂）对淀粉量的影响。分离表皮的保卫细胞剥离漂浮在气孔开放缓冲液中的碎片（Horrer ...
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| Analysis of 3D Cellular Organization of Fixed Plant Tissues Using a User-guided Platform for Image Segmentation
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Date:
2017-06-20
[Abstract] The advent of non-invasive, high-resolution microscopy imaging techniques and computational pipelines for high-throughput image processing has contributed to gain insights in plant organ morphogenesis at the cellular level. Confocal scanning laser microscopy (CSLM) allows the generation of three dimensional images constituted of serial optical sections reporting on stained subcellular structures. Fluorescent labels of cell walls or cell membranes, either chemically or through reporter proteins, are particularly useful for the analyses of tissue organization and cellular shapes in 3D. Image segmentation based on cell boundary signals is used as an input to generate 3D-segments representing cells. These digitalized, 3D objects provide quantitative data on cell shape, size, geometry, ...
[摘要] 非侵入性，高分辨率显微镜成像技术和高通量图像处理计算管道的出现有助于在细胞水平上获得植物器官形态发生的见解。共焦扫描激光显微镜（CSLM）允许产生由串联光学部件组成的三维图像，其报告染色的亚细胞结构。细胞壁或细胞膜的化学或通过报告蛋白的荧光标记对于3D中组织组织和细胞形状的分析特别有用。基于单元边界信号的图像分割被用作生成表示单元的3D段的输入。如果使用其他记录器，这些数字化3D对象提供有关细胞形状，大小，几何形状，位置或（细胞间）强度信号的定量数据。在这里，我们报告使用微观数据的图像分割的详细的注释工作流程。我们在拟南芥胚珠原基发育过程中对组织图案进行了研究。使用修改的假希夫碘化丙啶（mPS-PI）协议将整个心皮染色为细胞边界，通过CSLM以高分辨率获得3D图像，使用ImarisCell对单个细胞类型进行分段和注释。这允许与组织动力学研究相关的细胞形状和细胞数量的定量分析。
【背景】植物器官和组织动力学研究依赖于沿着发育进程的三维生长过程的分析。细胞数量，细胞大小和细胞形态的演变允许分别解释增殖，细胞扩增和各向异性的事件（Roeder等，2011; Barbier de Reuille等，2015; Bassel和Smith，2016; Coen和Rebocho， ...
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| Cytohistological Analyses of Mega-sporogenesis and Gametogenesis in Ovules of Limonium spp.
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Author:
Date:
2016-11-05
[Abstract] Limonium spp. are known to have sexual and apomixis (asexual reproduction through seeds) reproductive modes. Here, we present dissection protocol developed for ovules of Limonium spp. using differential interference contrast (DIC) microscopy. This protocol permits better handling of ovules and offers certain advantages over earlier techniques particularly in larger ovules. This method also enables observation of meiosis and embryo sac development in intact ovules, and the ready detection of events distinguishing sexual and apomictic development.
[摘要] Limonium 已知有性和无融合生殖（通过种子的无性繁殖）繁殖模式。在这里，我们提出解剖协议为胚珠的发芽。使用微分干涉对比（DIC）显微镜。该协议允许更好地处理胚珠，并提供优于早期技术，特别是在较大胚珠的某些优势。这种方法还能够观察到完整胚珠中的减数分裂和胚囊发育，以及容易检测到区别性和无序性发育的事件。
[背景] 发生在胚珠发育期间，有必要细胞学检查胚珠。这项研究可以涉及显微镜观察石蜡或树脂包埋，切片材料或清除的器官。在D'Amato（1940; 1949）的先驱作品中公开了对性和无融合生殖物种中胚珠和胚囊发育的第一次细胞学研究。在这些作品中，花使用Karpechenko的方法固定，包埋在石蜡中，切片并用Heidenhain的铁苏木精染色，其染色质和染色体在细胞核中染色。使用这些方法的花芽切片可导致由于单个细胞的部分破坏结构完整性而具有差质量的制备物。更容易的选择是清除福尔马林：乙酸：乙醇固定的器官并用纯的Mayer's hemalum染色（Wallis，1957; Stelly等人，1984）。这种技术需要少得多的时间和劳动，特别是对于通常在卵巢中形成小胚珠的物种，这是 Limonium ...
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