| In vitro Engineered DNA-binding Molecule-mediated Chromatin Immunoprecipitation (in vitro enChIP) Using CRISPR Ribonucleoproteins in Combination with Next-generation Sequencing (in vitro enChIP-Seq) for the Identification of Chromosomal Interactions
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] We have developed locus-specific chromatin immunoprecipitation (locus-specific ChIP) technologies consisting of insertional ChIP (iChIP) and engineered DNA-binding molecule-mediated ChIP (enChIP). Locus-specific ChIP is a method to isolate a genomic region of interest from cells while it also identifies what binds to this region using mass spectrometry (for protein) or next generation sequencing (for RNA or DNA) as described in Fujita et al. (2016a). Recently, we identified genomic regions that physically interact with a locus using an updated form of enChIP, in vitro enChIP, in combination with NGS (in vitro enChIP-Seq) (Fujita et al., 2017a). Here, we describe a protocol on in vitro enChIP to isolate a target locus for identification of ...
[摘要] 我们开发了基因座特异性染色质免疫沉淀（基因座特异性芯片）技术，包括插入ChIP（iChIP）和工程DNA-结合分子介导ChIP（enChIP）。 基因座特异性ChIP是一种从细胞中分离感兴趣的基因组区域的方法，同时它还使用质谱（用于蛋白质）或下一代测序（用于RNA或DNA）鉴定什么与该区域结合，如Fujita等人 （2016a）。 最近，我们使用更新后的enChIP形式，结合NGS（ in vitro enChIP-Seq），鉴定了与基因座物理相互作用的基因组区域（Fujimita et al。，2017a）。 在这里，我们描述了一个体外试验的方法，用于分离靶基因座以鉴定与基因座物理相互作用的基因组区域。
【背景】阐明基因组功能强调的分子机制需要鉴定与感兴趣的基因组区域相互作用的分子。为此，我们开发了由插入ChIP（iChIP）和工程化DNA结合分子介导的ChIP（enChIP）组成的基因座特异性染色质免疫沉淀技术（基因座特异性ChIP）技术（Fujita等人 ...
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| Teratoma Formation Assay for Assessing Pluripotency and Tumorigenicity of Pluripotent Stem Cells
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Author:
Date:
2017-08-20
[Abstract] Pluripotent stem cells such as induced pluripotent stem cells (iPSCs) and embryonic stem cells (ESCs) form teratomas when transplanted into immunodeficient mice. As teratomas contain all three germ layers (endoderm, mesoderm, ectoderm), teratoma formation assay is widely used as an index of pluripotency (Evans and Kaufman, 1981; Hentze et al., 2009; Gropp et al., 2012). On the other hand, teratoma-forming tumorigenicity also represents a major risk factor impeding potential clinical applications of pluripotent stem cells (Miura et al., 2009; Okano et al., 2013). Recently, we reported that iPSCs derived from naked mole-rat lack teratoma-forming tumorigenicity when engrafted into the testes of non-obese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) ...
[摘要] 多能干细胞，如诱导多能干细胞（iPSCs）和胚胎干细胞（ESC），当移植到免疫缺陷小鼠时，形成畸胎瘤。由于畸胎瘤包含所有三个胚层（内胚层，中胚层，外胚层），畸胎瘤形成测定被广泛用作多能性的指标（Evans和Kaufman，1981; Hentze等，2009; Gropp等，2012）。另一方面，畸胎瘤形成致瘤性也是阻碍多能干细胞潜在临床应用的主要危险因素（Miura et al。，2009; Okano等，2013）。最近，我们报道了由于ES细胞表达的Ras（ERAS）和替代物，嫁接到非肥胖型糖尿病/严重联合免疫缺陷型（NOD / SCID）小鼠的睾丸中，从裸鼠睾丸衍生的iPSC缺乏畸胎瘤形成致瘤性阅读框（ARF）依赖于该物种特异性的肿瘤抑制机制（Miyawaki等，2016）。在这里，我们描述了将多能干细胞移植到NOD / SCID小鼠的睾丸中以产生用于评估多能性和致瘤性的畸胎瘤的方法。
【背景】iPSCs和ESC用于再生医学细胞移植治疗中的应用。然而，当移植到免疫缺陷小鼠中时，这些细胞形成称为含有分化组织的畸胎瘤的肿瘤。因此，其畸胎瘤形成致瘤性的风险限制了其临床应用。几项研究报道了克服畸胎瘤形成肿瘤发生风险的方法（Itakura et al。，2017; Vazquez-Martin et ...
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| Identification of Proteins Interacting with Genomic Regions of Interest in vivo Using Engineered DNA-binding Molecule-mediated Chromatin Immunoprecipitation (enChIP)
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Author:
Date:
2014-05-20
[Abstract] Elucidation of molecular mechanisms of genome functions requires identification of molecules interacting with genomic regions of interest in vivo. To this end, it is useful to isolate the target regions retaining molecular interactions. We established locus-specific chromatin immunoprecipitation (ChIP) technologies consisting of insertional ChIP (iChIP) and engineered DNA-binding molecule-mediated ChIP (enChIP) for isolation of target genomic regions (Hoshino and Fujii, 2009; Fujita and Fujii, 2011; Fujita and Fujii, 2012; Fujita and Fujii, 2013a; Fujita and Fujii, 2013b; Fujita et al., 2013). Identification and characterization of molecules interacting with the isolated genomic regions facilitates understanding of molecular mechanisms of functions of the target genome ...
[摘要] 阐明基因组功能的分子机制需要在体内鉴定与感兴趣的基因组区域相互作用的分子。为此，分离保持分子相互作用的靶区是有用的。我们建立由插入ChIP（iChIP）和工程化的DNA结合分子介导的ChIP（enChIP）组成的基因组特异性染色质免疫沉淀（ChIP）技术用于靶基因组区域的分离（Hoshino和Fujii，2009; Fujita和Fujii，和Fujii，2012; Fujita和Fujii，2013a; Fujita和Fujii，2013b; Fujita等人，2013）。与分离的基因组区域相互作用的分子的鉴定和表征有助于理解靶基因组区域的功能的分子机制。在这里，我们描述enChIP，其中工程化的DNA结合分子，如锌指蛋白，转录激活样（TAL）蛋白和催化失活的Cas9（dCas9）加上小指南RNA（gRNA），被用于亲和纯化靶基因组区。 enChIP的方案如下所示：
1。产生锌指蛋白，TAL或dCas9加gRNA以识别感兴趣的基因组区域中的DNA序列。
2。工程化的DNA结合分子与标签和核定位信号（NLS）融合，并在待分析的细胞中表达。如果需要，所得细胞被交联，并裂解，DNA被片段化。将包括工程化DNA结合分子的复合物进行亲和纯化，例如免疫沉淀。分离的复合物保留分子与感兴趣的基因组区域相互作用。 ...
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