| Monitoring the Targeting of Cathepsin D to the Lysosome by Metabolic Labeling and Pulse-chase Analysis
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Author:
Date:
2017-11-05
[Abstract] Mannose 6-phosphate receptors function can be studied in living cells by investigating alterations in processing and secretion of their ligand Cathepsin D. The assay described here is well established in the literature and comprises the metabolic labeling of newly synthesized proteins with [35S] methionine-cysteine in HeLa cells to monitor Cathepsin D processing through secretory pathway and secretion using immunoprecipitation, SDS-PAGE and fluorography.
[摘要] 通过研究其配体组织蛋白酶D的加工和分泌的改变，可以在活细胞中研究甘露糖-6-磷酸受体功能。在此描述的测定在文献中已经很好地确定，并且包括新合成的蛋白质的代谢标记，其中[35 [S]甲硫氨酸半胱氨酸，以监测组织蛋白酶D处理，通过分泌途径和分泌使用免疫沉淀，SDS-PAGE和荧光。
【背景】组织蛋白酶d（CATD）是一种溶酶体天冬氨酸蛋白酶由甘露糖-6-磷酸受体（M6PRs）排序在哺乳动物细胞中该传输它从反面高尔基体网络到内涵体/溶酶体（戈什等人，2003 ）。将CatD合成为前体蛋白（〜52kDa），其在溶酶体中被切割以产生中间体（〜48kDa）或成熟的溶酶体形式（〜34kDa）。微量的前体蛋白质也从生物合成途径分泌（Benes et al。，2008）。 catD的丰度可以使用几种方法来确定，例如基于免疫荧光的染色（Poole等人，1972），蛋白质印迹，荧光活性测定（Bewley等人， （Hirst等人，2009; Kametaka等人，2007; Tavares等人，2011）或用脉冲追踪分析进行代谢标记（Hirst等人，2009; Kametaka等人， ...
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| Lentiviral shRNA Screen to Identify Epithelial Integrity Regulating Genes in MCF10A 3D Culture
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Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] MCF10A 3D culture system provides a reductionist model of glandular mammary epithelium which is widely used to study development of glandular architecture, the role of cell polarity and epithelial integrity in control of epithelial cell functions, and mechanisms of breast cancer. Here we describe how to use shRNA screening approach to identify critical cell pathways that couple epithelial structure to individual cell based responses such as cell cycle exit and apoptosis. These studies will help to interrogate genetic changes critical for early breast tumorigenesis. The protocol describes a library of lentiviral shRNA constructs designed to target epithelial integrity and a highly efficient method for lentiviral transduction of suspension MCF10A cultures. Furthermore, protocols are ...
[摘要] MCF10A 3D文化系统提供了腺体乳腺上皮的还原剂模型，其广泛用于研究腺体结构的发育，细胞极性和上皮完整性在上皮细胞功能的控制中的作用以及乳腺癌的机制。在这里我们描述如何使用shRNA筛选方法来识别关键细胞通路，夫妇上皮结构到个别细胞的反应，如细胞周期退出和凋亡。这些研究将有助于询问对早期乳腺肿瘤发生至关重要的遗传变化。该协议描述了设计用于靶向上皮完整性的慢病毒shRNA构建体的文库和用于悬浮MCF10A培养物的慢病毒转导的高效方法。此外，提供的协议设置MCF10A 3D文化在Matrigel的形态和细胞反应研究通过结构化照明和共聚焦显微镜分析免疫染色的三维结构。
关键字： 3D文化，MCF10A，shRNA，上皮完整性，免疫荧光染色，3D成像，形态测量分析
[背景] 上皮细胞形成高度组织的组织结构，其提供物理支持和用于协调细胞信号传导的结构化支架。跨上皮结构的这种协调的信号传导对于上皮生物学是基本的;使得上皮细胞在调节器官大小，形状，功能和基于个体细胞的应答中的动态联合作用（Roignot等人，2013; Shamir和Ewald，2014）。上皮信号传导的联合指挥还提供了一种强有力的肿瘤抑制机制，通过将外部和内部有丝分裂信号门控到静止的上皮组织（Partanen等人，2013; Rejon等人 ...
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| Minimal Bactericidal Concentration for Biofilms (MBC-B)
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Author:
Date:
2014-05-05
[Abstract] A biofilm is a multicellular consortium of surface associated microbes surrounded by a hydrated, extracellular polymer matrix. The biofilm matrix plays a critical role in preventing desiccation, acquiring nutrients, and provides community protection from environmental assaults. Importantly, biofilms are significantly more resistant to antimicrobials relative to their free-swimming counterparts. The level of antimicrobial tolerance is influenced by a number of factors, including genetic/adaptive resistance mechanisms, stage of biofilm development, and pharmacokinetics of the antibiotic. Here, we describe an in vitro microtiter-based assay to quantify the minimal bactericidal concentration for biofilms (MBC-B) for short exposure times (2 h). This exposure period is significantly ...
[摘要] 生物膜是由水合的细胞外聚合物基质包围的表面相关微生物的多细胞聚生体。生物膜基质在防止干燥，获得营养物质和提供社区保护免受环境攻击中起关键作用。重要的是，相对于其自由游泳的对应物，生物膜显着地更抗抗微生物剂。抗微生物耐受性的水平受许多因素影响，包括遗传/适应性抗性机制，生物膜发育阶段和抗生素的药代动力学。在这里，我们描述了一种基于体外微量滴定的测定法，用于定量短曝光时间（2小时）的生物膜（MBC-B）的最小杀菌浓度。该暴露时间显着短于传统方案中描述的标准过夜和24小时治疗。开发该测定法以接近抗生素在其被代谢，被宿主蛋白螯合或消化之前在一次性治疗期间可用的时间。
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