| In vivo Analysis of Cyclic di-GMP Cyclase and Phosphodiesterase Activity in Escherichia coli Using a Vc2 Riboswitch-based Assay
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Author:
Date:
2018-03-05
[Abstract] Cyclic di-guanosine monophosphate (c-di-GMP) is a ubiquitous second messenger that regulates distinct aspects of bacterial physiology. It is synthesized by diguanylate cyclases (DGCs) and hydrolyzed by phosphodiesterases (PDEs). To date, the activities of DGC and PDE are commonly assessed by phenotypic assays, mass spectrometry analysis of intracellular c-di-GMP concentration, or riboswitch-based fluorescent biosensors. However, some of these methods require cutting-edge equipment, which might not be available in every laboratory. Here, we report a new simple, convenient and cost-effective system to assess the function of DGCs and PDEs in E. coli. This system utilizes the high specificity of a riboswitch to c-di-GMP and its ability to regulate the expression of a downstream ...
[摘要] 环状二磷酸鸟苷（c-di-GMP）是一种无处不在的第二信使，它调节细菌生理学的不同方面。 它由diguanylate环化酶（DGC）合成并被磷酸二酯酶（PDE）水解。 迄今为止，通常通过表型分析，细胞内c-di-GMP浓度的质谱分析或基于核糖开关的荧光生物传感器来评估DGC和PDE的活性。 但是，其中一些方法需要尖端设备，而这些设备可能不适用于每个实验室。 在这里，我们报告了一个新的简单，方便和具有成本效益的系统，用于评估E中DGC和PDE的功能。大肠杆菌。 该系统利用核糖开关对c-di-GMP的高特异性及其响应于c-di-GMP浓度而调节下游β-半乳糖苷酶报道基因的表达的能力。 在该协议中，我们描述了该系统的构建及其用于评估DGC和PDE酶的活性。
【背景】Cyclic-di-GMP是细菌中重要且无处不在的第二信使，其调节各种过程，例如运动到衰退转变，生物膜形成，毒力和细胞周期进展（Römling等人， ，2013）。 GG（D / ...
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| Identification of Insertion Site by RESDA-PCR in Chlamydomonas Mutants Generated by AphVIII Random Insertional Mutagenesis
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] Chlamydomonas reinhardtii is frequently used as a model organism to study fundamental processes in photosynthesis, metabolism, and flagellar biology. Versatile tool boxes have been developed for this alga (Fuhrmann et al., 1999; Schroda et al., 2000; Schroda, 2006). Among them, forward genetic approach has been intensively used, mostly because of the high efficiency in the generation of hundreds of thousands of mutants by random insertional mutagenesis and the haploid nature therefore phenotypic analysis can be done in the first generation (Cagnon et al., 2013; Tunçay et al., 2013). A major bottleneck in the application of high throughput methods in a forward genetic approach is the identification of the genetic lesion(s) responsible for the ...
[摘要] 莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）是光合作用，代谢和鞭毛生物学的基础研究者。已经为这种藻类开发了多功能的工具箱（Fuhrmann等人，1999; Schroda等人，2000; Schroda，2006）。其中，正向遗传方法已经被广泛使用，主要是因为通过随机插入诱变产生了数十万个突变体的高效率，并且可以在第一代进行单倍体性质表型分析（Cagnon等人 2013，Tunçay et。 2013）。在正向遗传方法中应用高通量方法的主要瓶颈是鉴定与观察到的表型相关的遗传损伤。在该协议中，我们详细描述了最初在（González-Ballester等人，2005）中报道的限制性定点扩增PCR（RESDA-PCR）的改进版本。优化包括引物组合的优化，DNA聚合酶的选择，PCR循环参数的优化以及PCR产物直接测序的应用。这些修改使得获得特定的PCR产物变得更加容易，并且加速了亚克隆步骤以更快地获得测序数据。
【背景】除了限制酶位点定向扩增PCR（RESDA-PCR）（González-Ballester等人，2005）之外，还发现了其它几种分子技术。 包括Genome ...
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| Protocol for the Preparation of Arabidopsis Meiotic Chromosome Spreads and Fluorescent in situ Hybridization
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Author:
Date:
2014-04-20
[Abstract] This protocol is a more detailed version of previous protocols (Yang et al., 2011; Bolaños-Villegas et al., 2013) developed for the examination of meiotic chromosome spreads. Meiotic chromosome spreads are useful to determine the presence of defects in chromosome pairing and segregation. The protocol also describes how to perform fluorescent in situ hybridization experiments with a centromere probe used to label chromosomes.
[摘要] 该方案是为研究减数分裂染色体扩散而开发的以前方案的更详细的版本（Yang等人，2011;Bolaños-Villegas等人，2013）。 减数分裂染色体扩散可用于确定染色体配对和分离中缺陷的存在。 该方案还描述了如何使用用于标记染色体的着丝粒探针进行荧光原位杂交实验。
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