| Preparation of Sequencing RNA Libraries through Chemical Cross-linking Coupled to Affinity Purification (cCLAP) in Saccharomyces cerevisiae
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Author:
Date:
2018-10-05
[Abstract] Ribonucleoprotein particles (mRNPs) are complexes consisting of mRNAs and RNA-binding proteins (RBPs) which control mRNA transcription localization, turnover, and translation. Some mRNAs within the mRNPs have been shown to undergo degradation or storage. Those transcripts can lack general mRNA elements, like the poly(A) tail or 5’ cap structure, which prevent their identification through the application of widely-used approaches like oligo(dT) purification. Here, we describe a modified cross-linking affinity purification protocol (cCLAP) based on existing cross-linking and immunoprecipitation (CLIP) methods to isolate mRNAs which could be deadenylated, decapped and/or partially degraded in mRNPs, opening the possibility to detect different types of non-coding RNAs (ncRNAs). Once isolated, ...
[摘要] 核糖核蛋白颗粒（mRNP）是由mRNA和RNA结合蛋白（RBP）组成的复合物，其控制mRNA转录定位，转换和翻译。已显示mRNP内的一些mRNA经历降解或储存。那些转录物可能缺乏一般的mRNA元件，如poly（A）尾或5'帽结构，这通过应用广泛使用的方法如oligo（dT）纯化来阻止它们的鉴定。在这里，我们描述了基于现有的交联和免疫沉淀（CLIP）方法的修饰的交联亲和纯化方案（cCLAP），以分离mRNP中可被去腺苷酸化，去除和/或部分降解的mRNA，从而开启了检测不同的可能性。非编码RNA（ncRNA）的类型。分离后，将RNA进行衔接子连接，然后进行下一代测序（NGS）。由于快速有效的交联和淬灭步骤，该方案也适用于瞬时诱导的mRNP颗粒。实例包括由外在应激物触发的处理体（PB）或应力颗粒（SG）。其重现性和广泛应用使该方案成为研究特定RNP的RNA组成的有用且有力的工具。
【背景】mRNP内转录物的表征对于理解细胞转录和转录后过程至关重要。通过交联和免疫沉淀，然后通过RNA-Seq从mRNP颗粒中分离RNA已经成为鉴定mRNA靶标的常用方法（Tagwerker et al。，2006; Hafner et al。，2010; Kishore et al。，2011）。 ...
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| Studying the Role of Microglia in Neurodegeneration and Axonal Regeneration in the Murine Visual System
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Author:
Date:
2018-08-20
[Abstract] Microglia reside in the central nervous system (CNS) and are involved in the maintenance of the physiologic state. They constantly survey their environment for pathologic alterations associated with injury or diseases. For decades, researchers have investigated the role of microglia under different pathologic conditions, using approaches aiming to inhibit or eliminate these phagocytic cells. However, until recently, methods have failed to achieve complete depletion. Moreover, treatments often affected other cells, making unequivocal conclusions from these studies difficult. Recently, we have shown that inhibition of colony stimulating factor 1 receptor (CSF1R) by oral treatment with PLX5622 containing chow enables complete depletion of retinal microglia and almost complete microglia ...
[摘要] 小胶质细胞存在于中枢神经系统（CNS）中，并参与维持生理状态。他们不断调查他们的环境，以寻找与受伤或疾病相关的病理改变。几十年来，研究人员使用旨在抑制或消除这些吞噬细胞的方法，研究了小胶质细胞在不同病理条件下的作用。然而，直到最近，方法未能实现完全耗尽。此外，治疗通常会影响其他细胞，因此难以从这些研究中得出明确的结论。最近，我们已经表明，通过用含有食物的PLX5622口服治疗抑制集落刺激因子1受体（CSF1R）能够完全消除视网膜小胶质细胞并且几乎完全消除视神经中的小胶质细胞，而不影响外周巨噬细胞或其他细胞。使用这种方法，我们研究了小胶质细胞在视网膜神经保护中的作用以及在不同条件下受损视神经中的轴突再生。因此，这里提出的这种有效，可靠和易于使用的方案将使研究人员能够明确地研究小胶质细胞对神经变性和轴突再生的贡献。该方案还可以容易地扩展到视觉系统中的急性和慢性损伤或疾病的其他范例。
【背景】 小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）的常驻免疫细胞，其持续扫描其环境以进行病理改变（Nimmerjahn et al。，2005）。在检测到这种情况后，小胶质细胞转变为活化状态并向其进行不同任务的来源迁移（Kreutzberg，1996; Davalos et ...
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| Quantitative ChIP-seq by Adding Spike-in from Another Species
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Author:
Date:
2018-08-20
[Abstract] Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a routine procedure in the lab; however, epigenome-wide quantitative comparison among independent ChIP-seq experiments remains a challenge. Here, we contribute an experimental protocol combined with a computational workflow allowing quantitative and comparative assessment of epigenome using animal tissues.
[摘要] 染色质免疫沉淀，然后测序（ChIP-seq）是实验室中的常规程序; 然而，独立ChIP-seq实验之间的表观基因组范围的定量比较仍然是一个挑战。 在这里，我们提供了一个实验方案，结合计算工作流程，允许使用动物组织定量和比较评估表观基因组。
【背景】 修饰组蛋白的染色质和表观遗传复合物调节DNA对转录机制的可及性，从而允许直接控制基因表达。为了表征组蛋白修饰的表观基因组特征，染色质免疫沉淀然后测序（ChIP-seq）已成为一种广泛使用的方法。然而，传统的ChIP-seq方案本质上不是定量的，因此禁止直接比较源自不同细胞类型的样品或经历过不同遗传或化学扰动的细胞。尽管已经提出了几种 in silico 归一化方法来克服这个缺点，但仍然缺乏基于实验的策略。 2014年，奥兰多等人（2014）开发了一种名为ChIP的方法，该方法使用参考外源基因组（ChIP-Rx），该方法利用恒定量的参考或''spike-in''表观基因组基于细胞的表观基因组比较。在当前的协议中，我们通过使用映射的尖峰参考表观基因组的百分比来改进该方法。我们已成功应用此协议直接比较来自动物组织的两个或更多ChIP-seq数据集。
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