| CENP-C Phosphorylation by CDK1 in vitro
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Author:
Date:
2021-01-05
[Abstract] Accurate chromosome segregation during mitosis requires the kinetochore, a large protein complex, which makes a linkage between chromosomes and spindle microtubes. An essential kinetochore component, CENP-C, is phosphorylated by Cyclin-B-Cyclin dependent kinase 1 (CDK1) that is a master kinase for mitotic progression, promoting proper kinetochore assembly during mitosis. Here, we describe an in vitro CDK1 kinase assay to detect CENP-C phosphorylation using Phos-tag SDS-PAGE without radiolabeled ATP. Our protocol has advantages in ease and safety over conventional phosphorylation assays using [γ-32P]-ATP, which has potential hazards despite their better sensitivity. The protocol described here can be applicable to other kinases and be also useful for analysis of phospho-sites in ...
[摘要] [摘要]在有丝分裂过程中，准确的染色体分离需要动线粒体（一种大型蛋白复合物），使染色体与纺锤体微管之间形成联系。必需的线粒体成分CENP-C被细胞周期蛋白B-细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）磷酸化，该激酶是有丝分裂进程的主要激酶，在有丝分裂过程中促进适当的线粒体组装。在这里，我们描述了一种体外CDK1激酶测定法，可使用Phos -tag SDS-PAGE检测CENP-C磷酸化而无放射性ATP 。ø乌尔协议具有使用[γ-在容易且安全优于常规磷酸化试验的优点32 P] -ATP ，其具有潜在危险，尽管其敏感性更高。该协议describ编这里可以适用于其他激酶并且也用于在基板磷酸位点的分析是有用的体外。
[背景]细胞周期蛋白-B细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）是有丝分裂的主要调节剂，其磷酸化许多靶标以确保有丝分裂的进展（Nurse，1990 ; Malumbres and Barbacid ，2005 ）。在有丝分裂期间，携带遗传信息的染色体被平均分为两个子细胞。线粒体是关键的大蛋白复合物，通过在染色体和纺锤体微管之间架桥来确保忠实的染色体分离（Fukagawa和Earnshaw，2014）。组成动线粒的各种蛋白质被CDK1磷酸化（Gascoigne等人，2013; Nishino等人，2013; Hara等人，2018b; ...
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| Self-organization Assay for Min Proteins of Escherichia coli in Micro-droplets Covered with Lipids
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Date:
2020-03-20
[Abstract] The Min system determines the cell division plane of bacteria. As a cue of spatiotemporal regulation, the Min system uses wave propagation of MinD protein (Min wave). Therefore, the reconstitution of the Min wave in cell-sized closed space will lead to the creation of artificial cells capable of cell division. The Min waves emerge via coupling between the reactions among MinD, MinE, and ATP and the differences in diffusion rate on the cell membrane and in the cytoplasm. Because Min waves appear only under the balanced condition of the reaction-diffusion coupling, special attentions are needed towards several technical points for the reconstitution of Min waves in artificial cells. This protocol describes a technical method for stably generating Min waves in artificial cells.
[摘要] [摘要 ] Min系统确定细菌的细胞分裂平面。作为时空调节的提示，Min系统使用MinD 蛋白的波传播（Min wave）。因此，Min波在细胞大小的封闭空间中的重构将导致能够分裂细胞的人造细胞的产生。闵波出现经由耦合之间反应小号中MinD的，的MinE ，和ATP 和所述differenc ES 在细胞膜上的扩散速度和在细胞质中。因为最小波仅在反应扩散耦合的平衡条件下出现， 特别关注，需要对几个技术要点为闽波在人造细胞重建。该协议描述了一种在人造细胞中稳定产生Min波的技术方法。
[背景 ] 敏系统，它决定了细胞分ER 对称细胞分裂，是在细菌细胞内的组织系统的最显着的例子之一（Rothfield 等人，2005;和罗利特马戈林，2013年）。敏系统使用图案形成在细胞内的时间依赖性蛋白梯度的公知的作为敏波（宽松等人，2008; Halatek和Frey，2012;邦尼等人，2013; Zieske 。等人，2016 ; Kohyama 。等人， 2019 ）。Min波是由两种蛋白MinD 和MinE 的反应扩散耦合产生的。通过与ATP结合，MinD 形成二聚体并附着在膜上。的MinE 被招募到的ATP MinD的和诱导ATP酶的活性MinD的。通过MinE ，ATP- MinD 变为ADP- MinD ，并从膜上脱离。ADP- MinD的被转换回ATP- ...
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| Isolation of Keratan Sulfate Disaccharide-branched Chondroitin Sulfate E from Mactra chinensis
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2017-08-05
[Abstract] Glycosaminoglycans (GAGs) including chondroitin sulfate (CS), dermatan sulfate (DS), heparin (HP), heparan sulfate (HS) and keratan sulfate (KS) are linear, sulfated repeating disaccharide sequences containing hexosamine and uronic acid (or galactose in the case of KS). Recently, a keratan sulfate (KS) disaccharide [GlcNAc6S(β1-3)Galactose(β1-]-branched CS-E was identified from the clam species M. chinensis. Here, we report the isolation protocol for KS-branched CS from M. chinensis.
[摘要] 包括硫酸软骨素（CS），硫酸皮肤素（DS），肝素（HP），硫酸乙酰肝素（HS）和硫酸角质素（KS）的糖胺聚糖（GAGs）是含有己糖胺和糖醛酸（或半乳糖 KS案）。 最近，从蛤蜊种群中鉴定了硫酸角质素（KS）二糖[GlcNAc6S（β1-3）半乳糖（β1 - ] - 支链的CS-E），这里我们报告了分离方案 用于来自中华猕猴桃的KS分枝CS。
【背景】在组织中发现GAG作为蛋白多糖（PG）糖缀合物的聚糖部分。 CS是由N，N-乙酰基-D-半乳糖胺（GalNAc）和葡萄糖醛酸（GlcA）的线性，硫酸化重复二糖序列组成的GAG型。另一种GAG类型的DS通过葡萄糖醛酸C5-差向异构酶对CS的作用进行生物合成，将其GlcA转化为CS差向异构体，艾杜糖醛酸（IdoA）。其他GAG类型HS和HEP由N，N-乙酰基-D-氨基葡糖（GlcNAc）和GlcA / IdoA的硫酸化重复二糖序列组成。 KS由GlcNAc和半乳糖的硫酸化重复二糖序列组成。其中，CS的结构变化，如硫酸化模式和岩藻糖基化，取决于物种和组织的来源。例如，具有结构[-4] GlcA（β1-3）GalNAc4S（β1-）（其中S表示磺酸盐残基）的A-单元是在哺乳动物或鸡气管软骨CS中发现的主要二糖，而C-具有结构[-4] ...
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