| Rubisco Extraction and Purification from Diatoms
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Author:
Date:
2017-03-20
[Abstract] This protocol describes a method to extract ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase oxygenase (Rubisco) from diatoms (Bacillariophyta) to determine catalytic performance. This protocol has been adapted from use in cyanobacteria and higher plants (Andrews, 1988; Whitney and Sharwood, 2007). First part (steps A1-A3) of the extraction provides a crude extract of Rubisco that is sufficient for carboxylation assays to measure the Michaelis constant for CO2 (KC) and the catalytic turnover rate (kcatc). However, the further purification steps outlined (steps B1-B4) are needed for measurements of Rubisco CO2/O2 Specificity (SC/O, [Kane et al., 1994]).
[摘要] 该方案描述了从硅藻（“芽孢杆菌”）提取核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶（Rubisco）的方法以确定催化性能。该方案已经在蓝细菌和高等植物中得到了应用（Andrews，1988; Whitney and Sharwood，2007）。提取的第一部分（步骤A1-A3）提供Rubisco的粗提取物，其足以用于羧化测定以测量CO 2（K 3 C）的Michaelis常数和催化更换率（ k c ）。然而，为了测量Rubisco CO 2 / O 2特异性（S C / O ）需要进一步的纯化步骤（步骤B1-B4） >，[Kane等人，1994]）。背景 核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶（Rubisco，EC 4.1.1.39）催化了CO 2光合同化的第一步，因此在光合作用和全球碳循环中起着重要的作用。 Rubisco已经从古菌，细菌，藻类和植物的各种生物体中分离出来，并且在生物体之间显示出各种各样的动力学（Galmes等人，2014年; Tcherkez等人，2006; Whitney等人，2011）。 Rubisco动力学的知识是了解光合作用以及因此碳的生物沉积物对人为CO ...
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| Isolation of Outer Membrane Vesicles from Phytopathogenic Xanthomonas campestris pv. campestris
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Author:
Date:
2017-03-05
[Abstract] Gram-negative bacteria naturally release outer membrane vesicles (OMVs) to the surrounding environment. OMVs contribute to multiple processes, such as cell-cell communication, delivery of enzymes and toxins, resistance to environmental stresses and pathogenesis. Little is known about OMVs produced by plant-pathogenic bacteria, and their interactions with host plants. The protocol described below discusses the isolation process of OMVs from Xanthomonas campestris pv. campestris strain 33913, a bacterial pathogen of Crucifiers. Nevertheless, this protocol can be used and/or adapted for isolation of OMVs from other phytopathogenic bacteria to promote the study of OMVs in the context of plant-microbe interactions.
[摘要] 革兰氏阴性细菌自然释放外膜囊泡（OMVs）到周围环境。 OMV有助于多个过程，如细胞通讯，酶和毒素的传递，对环境的压力和发病机制的抵抗。对植物病原菌产生的OMV及其与宿主植物的相互作用知之甚少。下面描述的协议讨论了野生黄单胞菌（Manthomonas campestris）的OMV的隔离过程。菌种33913（一种Crucizer的细菌病原体）。然而，该方案可以用于和/或适于将OMV与其他植物病原细菌分离，以促进在植物 - 微生物相互作用的背景下对OMV的研究。
背景 细胞外泡（EV）释放是许多生物从生命各个领域共享的过程。在革兰氏阴性细菌中，大多数EV是外膜起泡的结果，最终夹住细菌细胞壁，因此被称为外膜囊泡（OMV）。 OMV的研究重点是OMV生物发生，货物，功能和与宿主生物的相互作用。迄今为止，大多数关于OMV的研究集中在人类和环境细菌的细菌病原体上，然而对植物病原菌的OMV研究很少。这里描述的协议是由Chutkan等人描述的方案改编的。 （2013）稍作修改，并在此介绍植物病原体X。 campestris pv。 campestris 。为了我们的理解，这是第一个完全详细的OMV与植物生长细菌分离的方案，我们希望它可以作为对这一主题感兴趣的其他研究组的指导性协议。
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| Microplate Assay to Study Carboxypeptidase A Inhibition in Andean Potatoes
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Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] Metallocarboxypeptidases (MCP) are zinc-dependent exopeptidases that catalyze the hydrolysis of C-terminal amide bonds in proteins and peptides. They are involved in a wide range of physiological processes and have recently emerged as relevant drug targets in biomedicine (Arolas et al., 2007). In this context, the study and discovery of new MCP inhibitors from plants constitute a valuable approach for the development of new therapeutic strategies. Herein we describe a simple and accessible microplate method for the study of the specific and dose-response carboxypeptidase A inhibitory activities present in Andean potato tubers. Our protocol combines an extraction method optimized for small protein inhibitors in plant tissues, with the measurement of enzyme kinetics using a ...
[摘要] 金属羧肽酶（MCP）是锌依赖性外肽酶，其催化蛋白质和肽中的C-末端酰胺键的水解。它们参与多种生理过程，并且最近作为生物医学中的相关药物靶标出现（Arolas等人，2007）。在这种情况下，从植物研究和发现新的MCP抑制剂构成了开发新的治疗策略的有价值的方法。在这里我们描述一种简单和可访问的微孔板方法研究特定和剂量反应羧肽酶A抑制活动存在于安第斯马铃薯块茎。我们的协议结合了针对植物组织中的小蛋白抑制剂优化的提取方法，使用酶标仪测量酶动力学。这些仪器能够在很短的时间内读取小样品体积，因此减少了高通量筛选实验的时间和成本。虽然本协议描述了安第斯土豆的研究，我们的方法也适用于分析其他植物样品。
关键字：金属羧肽酶，羧肽酶A，抑制剂，抑制活性，微孔板测定，土豆
[背景] 蛋白质蛋白酶抑制剂是作为其防御昆虫攻击的防御系统的一部分产生的伤口诱导分子（Graham等人，1981; Villanueva等人，1998）。在研究的抑制剂中，只有两种对MCP具有特异性，即，马铃薯羧肽酶抑制剂（PCI）及其在番茄植物（TCI）中发现的紧密同源物。在过去几十年中，Solanaceae中MCP抑制剂的存在已被广泛报道，揭示马铃薯（马铃薯）作为MCP抑制剂的最重要来源之一（Hass等人， ，1979;Obregón等人，2012; ...
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