| Isolation of Cytosol, Microsome, Free Polysomes (FPs) and Membrane-bound Polysomes (MBPs) from Arabidopsis Seedlings
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] The plant endomembrane system plays vital roles for synthesis, modification and secretion of proteins and lipids. From the classic view, only mRNAs encoding secreted proteins could be targeted to the endoplasmic reticulum (ER) for translation via a co-translational translocation manner, however, recently this model has been challenged by accumulative evidence that lots of cytosolic mRNAs could also associate with ER, and that some categories of small RNAs are enriched on ER. These results suggested unrevealed functions of ER beyond our current knowledge. The large scale identification of RNAs and proteins on microsome is crucial to demonstrating the ER function and the studies will be boosted by next generation sequencing technology. This protocol provides a technical workflow to isolate ...
[摘要] 植物内膜系统对蛋白质和脂质的合成，修饰和分泌起着至关重要的作用。 从经典观点来看，只有编码分泌蛋白质的mRNA才能通过协同翻译方式靶向内质网（ER）进行翻译，然而最近，这一模型已经被大量的细胞溶质mRNA也可能与 ER，并且一些类别的小RNA在ER上富集。 这些结果表明ER的功能超出了目前的知识。 在微粒体上大规模鉴定RNA和蛋白质对于显示ER功能至关重要，研究将由下一代测序技术提升。 该协议提供了从植物组织中分离细胞质，微粒体，游离多聚体（FP）和膜结合多聚体（MBP）的技术工作流程。 分离的级分适用于mRNA，小RNA和蛋白质的基因组广谱分析。
【背景】植物内膜系统对于细胞壁形成，脂质生物合成，蛋白质合成，修饰，折叠和贩运非常重要。根据共翻译易位模型，分泌蛋白N末端的信号肽由细胞溶质多核糖体合成，然后由ER上的信号识别粒子识别，其余蛋白质部分随后在ER上合成。根据该模型，只有编码分泌蛋白的mRNA可以被带到ER进行翻译（Peter和Johnson，1994）。然而，从哺乳动物和植物细胞ER（Lerner等人，2003; de ...
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| Glioma Induction by Intracerebral Retrovirus Injection
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Author:
Date:
2017-07-20
[Abstract] Glioblastoma (GBM) is the most common primary brain cancer in adults and has a poor prognosis. It is characterized by a high degree of cellular infiltration that leads to tumor recurrence, atypical hyperplasia, necrosis, and angiogenesis. Despite aggressive treatment modalities, current therapies are ineffective for GBM. Mouse GBM models not only provide a better understanding in the mechanisms of gliomagenesis, but also facilitate the drug discovery for treating this deadly cancer. A retroviral vector system that expresses PDGFBB (Platelet-derived growth factor BB) and inactivates PTEN (Phosphatase and tensin homolog) and P53 tumor suppressors provides a rapid and efficient induction of glioma in mice with full penetrance. In this protocol, we describe a simple and practical method for ...
[摘要] 成胶质细胞瘤（GBM）是成人中最常见的原发性脑癌，预后差。其特征在于高度的细胞浸润，导致肿瘤复发，非典型增生，坏死和血管生成。尽管采取积极的治疗方式，目前的疗法对GBM无效。小鼠GBM模型不仅提供了对胶质瘤发生机制的更好理解，而且有助于药物发现治疗这种致命的癌症。表达PDGFBB（血小板衍生生长因子BB）和灭活PTEN（磷酸酶和张力蛋白同源物）和P53肿瘤抑制因子的逆转录病毒载体系统提供了具有全面外显子的小鼠中胶质瘤的快速和有效的诱导。在该方案中，我们描述了一种简单实用的方法，用于在鼠脑中通过逆转录病毒注射诱导GBM形成。该系统对神经胶质瘤的诱导进行空间和时间控制，并允许用生物发光报告物评估治疗效果。
【背景】胶质母细胞瘤（GBM）是最具侵袭性的恶性脑肿瘤，不幸的是几乎总是致命的。尽管多种治疗方式有进展，但是尚未开发出治疗GBM的有效治疗方法。这种疾病的机制仍然知之甚少。动物模型一直是定义GBM发病机制和基因或药物治疗试验的非常重要的工具。已经开发了几种小鼠模型，其目的是产生尽可能接近模拟人类疾病的疾病，并表现出类似的分子，遗传和组织学特征。突出使用的模型是异种移植（Hingtgen等人，2008）模型，其中人类肿瘤细胞系可以在脑中原位移植以及在免疫受损的小鼠的皮下区域异位移植，提供了具有大肿瘤块在短时间内。遗传工程小鼠模型（GEMM）具有特异性增益的致癌活性或丧失肿瘤抑制通路，其类似于GBM中最频繁失调的通路中的扰动，导致啮齿类动物形成胶质瘤。 ...
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| Assay to Measure Interactions between Purified Drp1 and Synthetic Liposomes
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Author:
Date:
2017-05-05
[Abstract] A mitochondrion is a dynamic intracellular organelle that actively divides and fuses to control its size, number and shape in cells. A regulated balance between mitochondrial division and fusion is fundamental to the function, distribution and turnover of mitochondria (Roy et al., 2015). Mitochondrial division is mediated by dynamin-related protein 1 (Drp1), a mechano-chemical GTPase that constricts mitochondrial membranes (Tamura et al., 2011). Mitochondrial membrane lipids such as phosphatidic acid and cardiolipin bind Drp1, and Drp1-phospholipid interactions provide key regulatory mechanisms for mitochondrial division (Montessuit et al., 2010; Bustillo-Zabalbeitia et al., 2014; Macdonald et al., 2014; Stepanyants et al., 2015; ...
[摘要] 线粒体是一种动态的细胞内细胞器，主动分裂和融合以控制细胞的大小，数量和形状。线粒体分裂和融合之间的调节平衡是线粒体功能，分布和周转的基础（Roy等，2015）。线粒体分化是由动力蛋白相关蛋白1（Drp1）介导的，其是限制线粒体膜的机械化学GTP酶（Tamura等人，2011）。线粒体膜脂质如磷脂酸和心磷脂结合Drp1，并且Drp1磷脂相互作用提供线粒体分裂的关键调控机制（Montessuit等人，2010; Bustillo-Zabalbeitia等人2014年; Macdonald等人，2014年; Stepanyants等人，2015; Adachi等人，2016）。在这里，我们描述了使用纯化的重组Drp1和具有定义的一组磷脂的合成脂质体定量测量Drp1与脂质的相互作用的生物化学实验。该测定使得可以定义蛋白质 - 脂质相互作用的特异性以及头基和酰基链的作用。
背景 蛋白质和膜脂质的相互作用对于细胞如细胞器分裂中生物膜的重塑至关重要。在线粒体分裂中，Drp1限制线粒体膜并驱动该膜重塑过程。我们最近显示，信号磷脂，磷脂酸与Drp1相互作用，并通过限制线粒体上的组装分裂机制（Adachi等人，2016）产生启动步骤。 Drp1识别磷脂酸的头基和酰基链。为了分析Drp1-磷脂酸结合，我们建立了几种蛋白质 - ...
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