| Identification of Proteins Interacting with Genomic Regions of Interest in vivo Using Engineered DNA-binding Molecule-mediated Chromatin Immunoprecipitation (enChIP)
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Author:
Date:
2014-05-20
[Abstract] Elucidation of molecular mechanisms of genome functions requires identification of molecules interacting with genomic regions of interest in vivo. To this end, it is useful to isolate the target regions retaining molecular interactions. We established locus-specific chromatin immunoprecipitation (ChIP) technologies consisting of insertional ChIP (iChIP) and engineered DNA-binding molecule-mediated ChIP (enChIP) for isolation of target genomic regions (Hoshino and Fujii, 2009; Fujita and Fujii, 2011; Fujita and Fujii, 2012; Fujita and Fujii, 2013a; Fujita and Fujii, 2013b; Fujita et al., 2013). Identification and characterization of molecules interacting with the isolated genomic regions facilitates understanding of molecular mechanisms of functions of the target genome ...
[摘要] 阐明基因组功能的分子机制需要在体内鉴定与感兴趣的基因组区域相互作用的分子。为此，分离保持分子相互作用的靶区是有用的。我们建立由插入ChIP（iChIP）和工程化的DNA结合分子介导的ChIP（enChIP）组成的基因组特异性染色质免疫沉淀（ChIP）技术用于靶基因组区域的分离（Hoshino和Fujii，2009; Fujita和Fujii，和Fujii，2012; Fujita和Fujii，2013a; Fujita和Fujii，2013b; Fujita等人，2013）。与分离的基因组区域相互作用的分子的鉴定和表征有助于理解靶基因组区域的功能的分子机制。在这里，我们描述enChIP，其中工程化的DNA结合分子，如锌指蛋白，转录激活样（TAL）蛋白和催化失活的Cas9（dCas9）加上小指南RNA（gRNA），被用于亲和纯化靶基因组区。 enChIP的方案如下所示：
1。产生锌指蛋白，TAL或dCas9加gRNA以识别感兴趣的基因组区域中的DNA序列。
2。工程化的DNA结合分子与标签和核定位信号（NLS）融合，并在待分析的细胞中表达。如果需要，所得细胞被交联，并裂解，DNA被片段化。将包括工程化DNA结合分子的复合物进行亲和纯化，例如免疫沉淀。分离的复合物保留分子与感兴趣的基因组区域相互作用。 ...
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| Immunoplaque Assay (Influenza Virus)
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Author:
Date:
2013-11-05
[Abstract] Despite developed long time ago, plaque assay is still the gold standard for viral titer quantification in modern virology. The standard crystal violet-based plaque assay relies on virus’ ability to induce cytopathic effect (CPE) which limits the assay to lytic viruses. Alternative viral quantification assays such as 50% tissue culture infectious assay (TCID50) and genetic material quantification by Q-PCR provide a different way of viral quantification with their own shortcoming. In here, we modified the fluorescent focus assay and developed an antibody-based immunoplaque assay which provides a reliable and reproducible viral quantification independent of CPE. Our assay not only allows accurate determination of viral titer, but also provides information on viral kinetics, ...
[摘要] 尽管发展很久以前，斑块测定仍然是现代病毒学病毒滴度量化的黄金标准。 标准的基于结晶紫的斑块测定依赖于病毒诱导细胞病变效应（CPE）的能力，其限制了对裂解病毒的测定。 替代性病毒定量测定如50％组织培养感染测定（TCID 50）和通过Q-PCR的遗传物质定量提供了具有其自身缺点的病毒定量的不同方式。 在这里，我们修改荧光焦点测定和开发基于抗体的免疫斑检测提供可靠和可重复的病毒定量独立于CPE。 我们的测定不仅允许病毒滴度的精确测定，而且提供关于病毒动力学，遗传稳定性和病毒种群的纯度的信息。
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