| Lentiviral Knockdown of Transcription Factor STAT1 in Peromyscus leucopus to Assess Its Role in the Restriction of Tick-borne Flaviviruses
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Author:
Date:
2017-12-05
[Abstract] Cellular infection with tick-borne flaviviruses (TBFVs) results in activation of the interferon (IFN) signaling pathway and subsequent upregulation of numerous genes termed IFN stimulated genes (ISGs) (Schoggins et al., 2011). Many ISGs function to prevent virus pathogenesis by acting in a broad or specific manner through protein-protein interactions (Duggal and Emerman, 2012). The potency of the IFN signaling response determines the outcome of TBFV infection (Best, 2017; Carletti et al., 2017). Interestingly, data from our lab show that TBFV replication is significantly restricted in cells of the reservoir species Peromyscus leucopus thereby suggesting a potent antiviral response (Izuogu et al., 2017). We assessed the relative contribution of IFN ...
[摘要] 蜱传黄热病病毒（TBFV）的细胞感染导致干扰素（IFN）信号传导途径的激活和随后称为IFN刺激基因（ISG）（Schoggins等人，2011）的众多基因的上调。许多ISG通过蛋白质 - 蛋白质相互作用以广泛或特定的方式起作用来防止病毒发病（Duggal和Emerman，2012）。 IFN信号反应的效力决定了TBFV感染的结果（Best，2016; Carletti等人，2017）。有趣的是，我们实验室的数据显示TBFV复制在储库物种Peromyscus leucopus的细胞中显着受到限制，从而表明有效的抗病毒应答（Izuogu等人，2017）。我们评估干扰素信号对抗性的相对贡献。通过敲低IFN反应途径中的主要转录因子来抑制白血病。信号转导和转录激活因子1（STAT1）是专门针对在P。 leucopus细胞通过shRNA技术。我们进一步测试了基因敲低对细胞对IFN反应和限制病毒复制的能力的影响;结果表明当STAT1表达被改变时，leucopus细胞对IFN刺激的反应降低，并且对TBFV复制显着更敏感。
【背景】IFN信号是抵抗侵入宿主细胞的黄病毒的第一道防线（Robertson等人，2009; Lazear和Diamond，2015）。通过模式识别受体（PRR）检测与病毒颗粒相关的分子标记，然后通过转录因子引发下游信号从细胞释放1型IFN（Kawai ...
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| Isolation of Mouse Cardiac Neural Crest Cells and Their Differentiation into Smooth Muscle Cells
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] Cardiac neural crest cells (CNCCs) originate at the dorsal edge of the neural tube between the otic pit and the caudal edge of the 3rd somite, and migrate into the pharyngeal arches and the heart. We have shown that fibronectin (Fn1) plays an important role in the development of the CNCC by regulating the differentiation of CNCCs into vascular smooth muscle cells around pharyngeal arch arteries (Wang and Astrof, 2016). This protocol describes the isolation of CNCCs from the neural tube and from the caudal pharyngeal arches, and the differentiation of neural crest-derived cells into smooth muscle cells. This protocol was adapted from (Newgreen and Murphy, 2000; Pfaltzgraff et al., 2012).
[摘要] 心脏神经嵴细胞（CNCC）起源于神经管的背部边缘，位于第3个体节的耳穴和尾缘之间，并迁移到咽弓和心脏。 我们已经表明，纤连蛋白（Fn1）通过调节CNCCs到咽弓动脉周围的血管平滑肌细胞的分化，在CNCC的发展中起重要作用（Wang and Astrof，2016）。 该方案描述了CNCC与神经管和尾尾弓的分离，以及神经嵴衍生细胞分化成平滑肌细胞。 该方案从（Newgreen和Murphy，2000; Pfaltzgraff等人，2012）改编。
【背景】以前发表的方案描述了从神经管分离神经嵴细胞。然而，在耳孔和第三体细胞之间的神经管区域中的神经嵴细胞包括有助于许多不同细胞类型的神经嵴细胞群体;例如，迷走神经嵴细胞也来自该区域。在该方案中，我们修改了用于分离心脏神经嵴细胞的常规方法。而不是使用神经管，我们在胚胎期（E）9.5（22-25个体节期）使用尾部咽部弓形区。这是在将心脏神经嵴细胞分化为血管平滑肌细胞之前。神经嵴培养物通常含有污染性间充质细胞，通常表达平滑肌基因。为了鉴定神经嵴衍生细胞，我们从以下交叉产生的胚胎中分离出神经嵴细胞：Fn1flox / flox; ROSAmTmG / mTmG雌性小鼠×Fn1 +/-;Tfap2αIRESCre/ ...
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| TUNEL Assay to Assess Extent of DNA Fragmentation and Programmed Cell Death in Root Cells under Various Stress Conditions
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Author:
Date:
2017-08-20
[Abstract] DNA damage is one of the common consequences of exposure to various stress conditions. Different methods have been developed to accurately assess DNA damage and fragmentation in cells and tissues exposed to different stress agents. However, owing to the presence of firm cellulosic cell wall and phenolics, plant cells and tissues are not easily amenable to be subjected to these assays. Here, we describe an optimized TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling) assay-based protocol to determine the extent of DNA fragmentation and programmed cell death in plant root cells subjected to various stress conditions. The method described here has the advantages of simplicity, reliability and reproducibility.
[摘要] DNA损伤是暴露于各种压力条件的常见后果之一。 已经开发了不同的方法来准确评估暴露于不同应激剂的细胞和组织中的DNA损伤和碎裂。 然而，由于纤维素细胞壁和酚类物质的存在，植物细胞和组织不容易进行这些测定。 在这里，我们描述了优化的TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口标记）测定方法，以确定经受各种应激条件的植物根细胞中DNA片段化和程序性细胞死亡的程度。 这里描述的方法具有简单，可靠和重复性好的优点。
【背景】暴露于各种压力通常导致至少一定程度的DNA损伤，导致各种损伤，例如胸腺嘧啶二聚化，碱基烷基化，单链缺口和双链断裂（Bray和West，2005; Manova和Gruszka，2015）。在所有类型的DNA损伤中，DNA片段化在应激条件下特别令人关注，这可能是应激的直接影响（如用基因毒素治疗方法所观察到的）或间接作用（主要是通过过度产生的活性氧），甚至可能是两者的累积结果（Bray和West，2005; Kapoor等，2015）。这种DNA损伤必须由细胞的修复机械精确修复，否则可能会导致细胞死亡。为了维持正常状态，细胞利用依赖于三个非排他事件的DNA损伤反应。检测/识别损坏，其通过维修机械的访问，最后修复（Smerdon，1991）。
在细胞水平上应力适应的主要分子机制之一涉及对由于应激引起的受损DNA的DNA损伤和/或有效修复的抗性。因此，为了评估基因型的应激适应性，通常需要对DNA损伤进行准确评估。两种广泛用于检测植物DNA断裂的测定法是单细胞凝胶电泳 ...
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