| [3H]-Spiperone Competition Binding to Dopamine D2, D3 and D4 Receptors
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Author:
Date:
2013-10-20
[Abstract] This protocol is intended for use in 96 well plates (1,200 μl wells) but it can similarly be applied to standard test tubes (Levant, 2007). D2, D3, and D4 dopamine receptors are members of the D2-like class of dopamine receptors. They can be studied using the radioligand [3H]-spiperone, which is an antagonist binding to D2, D3, and D4 receptors with comparable affinity. A competition experiment is usually performed to determine the affinity of a compound for a receptor. If multiple subtypes or states of the receptor are present and the competing compound differentiates them, a competition binding experiment can quantify the relative contribution of the two subtypes or states; while resolution of more ...
[摘要] 该方案旨在用于96孔板（1,200μl孔），但它可以类似地应用于标准试管（Levant，2007）。 D 2，D 3和D 4多巴胺受体是D 2 S 2类多巴胺受体的成员受体。可以使用放射性配体[3 H] - 螺哌隆来研究它们，所述放射性配体是结合D 2，D 3和D 3的拮抗剂， 4>受体。通常进行竞争实验以确定化合物对受体的亲和力。如果存在受体的多种亚型或状态，并且竞争性化合物使它们分化，则竞争结合实验可以量化两种亚型或状态的相对贡献;而在两个以上亚型或状态的分辨率在理论上是可能的，在实际中它几乎是不可行的。因此，在各种浓度的未标记的目的化合物的存在下，定量放射性配体与受体的结合。在竞争研究中放射性配体的浓度应当是在饱和结合中测定的约2-3的K d值;这将允许受体的充分占据以获得强信号，并且同时避免由于高放射性配体浓度而使竞争变得太难。选择孵育时间和温度以允许与放射性配体和竞争剂的受体的缔合和解离之间形成平衡。值得注意的是，简单的竞争实验不一定证明未标记的药物和受体之间的相互作用的竞争性。如果相对于放射性配体的亲和力（<1nm），比放射性低（氚化），则需要高测定体积（≥1ml）以避免配体消耗;如果使用具有高表达密度的受体来源（例如表达的重组受体），这是特别重要的。所需竞争剂浓度的数量取决于实验的目标。如果仅需要对拮抗剂效力的粗略估计，则每个对数增量1-2个浓度就足够了。然而，如果目的是测试受体的可能亚型或状态，则需要每个对数增量3-5个浓度。如果可能，测定中最低的竞争剂浓度不应引起任何可检测的抑制，而最高浓度应完全消除特异性结合。每个实验可以分为不同的步骤，如测定制备，膜制备，温育，过滤，样品计数和数据分析。为了使实验误差最小化，所有测定至少一式两份进行。另外，总结合和非特异性结合的重复应包括在测定中;用于定义非特异性结合（nsb）的试剂应当是与放射性配体不同的化学（不同的家族）和物理上（避免两种亲脂性化合物的组合），以避免伪像。对于所选择的测定条件的具体益处的讨论参见van wieringen等人（2013）（拷贝可以从作者获得）。
wieringen等人（2013）（拷贝可以从作者获得）。=""> ...
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| [3H]-Spiperone Saturation Binding to Dopamine D2, D3 and D4 Receptors
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Author:
Date:
2013-10-20
[Abstract] This protocol is intended for use in 96 well plates (1,200 μl wells) but it can similarly be applied to standard test tubes (Levant, 2007). D2, D3, and D4 dopamine receptors are members of the D2-like class of dopamine receptors. They can be studied using the radioligand [3H]-spiperone, which is an antagonist binding to D2, D3, and D4 receptors with comparable affinity. A saturation assay can be used to determine the affinity of a radioligand to a receptor (Kd) and to determine the total number of receptors present in the assay (Bmax). If saturation binding experiments are performed in the absence and presence of a fixed concentration of another, not radiolabeled ligand, it can ...
[摘要] 该方案旨在用于96孔板（1,200μl孔），但它可以类似地应用于标准试管（Levant，2007）。 D 2，D 3和D 4多巴胺受体是D 2 S 2类多巴胺受体的成员受体。可以使用放射性配体[3 H] - 螺哌隆来研究它们，所述放射性配体是结合D 2，D 3和D 3的拮抗剂， 4>受体。饱和测定可用于测定放射性配体与受体的亲和力（K d），并测定测定中存在的受体的总数（B max） 。如果在不存在和存在固定浓度的另一种，而不是放射性标记的配体的情况下进行饱和结合实验，也可以确定其他配体是否以竞争性方式起作用。如果相对于放射性配体的亲和力（<1nm），比放射性低（氚化），则需要高测定体积（≥1ml）以避免配体消耗;如果使用具有高表达密度的受体来源（例如表达的重组受体），这是特别重要的。为了获得这些参数的可靠估计，必须测试至少6种不同浓度的放射性配体，但是特别是当在给定的组织或细胞类型中首次检测到受体时，更大数量的浓度是有帮助的。选择孵育时间和温度以允许与放射性配体和竞争剂的受体的缔合和解离之间形成平衡。每个实验可以分为不同的步骤，如测定制备，膜制备，温育，过滤，样品计数和数据分析。为了使实验误差最小化，所有测定至少一式两份进行。应制备放射性配体稀释液以覆盖所需的浓度范围。最佳地，这些浓度应当覆盖高范围（对应于5-10×k d且因此受体的饱和）和低范围（k="" d）附近，从而在没有过度外推的情况下可以可靠地估计k="" sub和b="" max。在每种放射性配体浓度下，应确定总和非特异性结合;用于定义非特异性结合（nsb）的试剂应当是与放射性配体不同的化学（不同的家族）和物理上（避免两种亲脂性化合物的组合），以避免伪像。对于选择的测定条件的具体益处的讨论参见van=""> ...
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