| Protein Expression and Purification of the Hsp90-Cdc37-Cdk4 Kinase Complex from Saccharomyces cerevisiae
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Author:
Date:
2017-10-05
[Abstract] Interactions between Hsp90, its co-chaperone Cdc37 and kinases have been biochemically studied for over three decades and have been shown to be functionally important in organisms from yeast to humans. However, formation of a stable complex for structural studies has been elusive. In this protocol we describe expression and purification of Hsp90-Cdc37-Cdk4 kinase protein complex from Saccharomyces cerevisiae utilizing the viral 2A sequences to titrate the three proteins at similar levels.
[摘要] Hsp90，其伴侣伴侣Cdc37和激酶之间的相互作用已经在三十多年的生物化学研究中被证明在酵母与人类的生物体内在功能上是重要的。 然而，形成一个稳定的结构研究复合物是难以捉摸的。 在该方案中，我们描述了利用病毒2A序列以相似水平滴定三种蛋白质的来自酿酒酵母的Hsp90-Cdc37-Cdk4激酶蛋白复合物的表达和纯化。
【背景】Hsp90分子伴侣与其客体激酶之间的稳定形成复合物已经被证明在体外是难治性的。以前的工作表明，Hsp90的共伴伴Cdc37与昆虫Sf9细胞中的客体激酶的过表达导致Sf9 Hsp90，外源Cdc37和外源激酶（Vaughan等人，2006）之间的稳定复合物。然而，昆虫细胞培养需要特殊的设备，比其他研究较好的表达系统（如细菌和酵母）要难以进行遗传操作，并且显着较慢地生长和克隆。上述蛋白质在E中的共表达。大肠杆菌不产生可溶性激酶/稳定复合物。我们认为，酿酒酵母将具有必要的机制来帮助折叠和促进复合物的形成，并试图通过共同表达这些蛋白质来产生人Hsp90β，人Cdc37和人Cdk4激酶之间的复合物， S上。酵母。为了获得三种蛋白质的化学计量表达，我们利用病毒2A肽，其允许三个蛋白质在一个mRNA上转录，随后在翻译阶段切割。该系统已被用于人类细胞系和兔网状细胞（Kim等人，2011; ...
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| Aldicarb-induced Paralysis Assay to Determine Defects in Synaptic Transmission in Caenorhabditis elegans
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Author:
Date:
2017-07-20
[Abstract] Aldicarb treatment causes an accumulation of acetylcholine in the synaptic cleft of the neuromuscular junction, resulting in sustained muscle activation and eventually paralysis. Aldicarb-induced paralysis assay is an easy and fast method to determine whether synaptic transmission of a C. elegans mutant of interest is altered. This assay is based on the correlation of the rate of neurotransmitter release with the rate of paralysis. In this protocol, we describe a method for simultaneously assessing the aldicarb sensitivity of animals with different genotypes.
[摘要] 涕灭威的治疗导致神经肌肉接头突触裂缝中的乙酰胆碱积聚，导致持续的肌肉活化并最终导致麻痹。 涕灭威诱导的麻痹测定是确定是否突触传播的一种简单且快速的方法。 线虫兴趣突变体被改变。 该测定是基于神经递质释放速率与麻痹率的相关性。 在该方案中，我们描述了同时评估具有不同基因型的动物的涕灭威敏感性的方法。
【背景】突触传递通过动作电位到达突触前末端而开始，这又导致神经递质的释放。释放的神经递质结合并激活突触后受体（Sudhof，2013）。 ℃。线虫运动由乙酰胆碱释放兴奋性运动神经元和GABA（γ-氨基丁酸）释放抑制运动神经元控制（Richmond和Jorgensen，1999; ...
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| Phenotypic Profiling of Candida glabrata in Liquid Media
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] Here, we describe a method for a large-scale liquid screening approach in C. glabrata. This liquid media method offers several distinct advantages over solid media approaches. This includes growth measurement on a plate reader instead of comparing growth by eye-sight. Furthermore, the liquid method requires lower amounts of antifungals and offers a higher sensitivity. While this method has been optimized for C. glabrata it might be used for other Candida species and yeast-like fungi as well.
[摘要] 在这里，我们描述了一种用于大规模液体筛选方法的方法。 glabrata 。 这种液体介质方法比固体介质方法提供了几个明显的优点。 这包括平板阅读器的增长测量，而不是通过视力来比较增长。 此外，液体方法需要较少量的抗真菌剂并提供更高的灵敏度。 虽然这种方法已经针对C进行了优化。 glabrata 也可以用于其他念珠菌物种和酵母样真菌。
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