| Transfection and Activation of CofActor, a Light and Stress Gated Optogenetic Tool, in Primary Hippocampal Neuron Cultures
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Author:
Date:
2021-04-20
[Abstract] Proteins involved in neurodegeneration can be coupled with optogenetic reagents to create rapid and sensitive reporters to provide insight into the biochemical processes that mediate the progression of neurodegenerative disorders, including Alzheimer’s Disease (AD). We have recently developed a novel optically-responsive tool (the ‘CofActor’ system) that couples cofilin and actin (key players in early stage cytoskeletal abnormalities associated with neurodegenerative disorders) with light-gated optogenetic proteins to provide spatial and temporal resolution of oxidative and energetic stress-dependent biochemical events. In contrast to currently available small-molecule based biosensors for monitoring changes in the redox environment of the cell, CofActor is a ...
[摘要] [摘要]参与神经变性蛋白质可具有耦合光遗传学试剂来创建快速且灵敏的记者到provid Ë洞察介导的神经变性疾病，包括进展的生化过程阿尔茨海默氏病（AD）。我们最近开发了一种新型光学-响应工具（“辅”系统）夫妇COF伊林和行动中使用（与神经退行性疾病相关的早期阶段，细胞骨架异常关键球员）光门控光遗传学 蛋白质提供时空分辨率的氧化和高能应激依赖的生化事件。与目前可用的基于小分子的生物传感器来监测细胞氧化还原环境的变化相比，CofActor是一种光激活的，遗传编码的氧化还原传感器，可以通过精确的空间和时间控制来激活。在这里，我们描述了从新生小鼠制备的解离海马神经元培养物中CofActor系统的表达和激活的协议。将培养物转染用大号ipofectamine上的第五天体外（DIV5），然后暴露于细胞应激诱导刺激，导致的肌动蛋白的形成丝切蛋白可使用活细胞成像技术可以观察到杆。本文所述的方案可用于研究暴露于神经退行性刺激（例如毒性Aβ42低聚物）的活神经元中与压力相关的细胞骨架失调。此外，从AD的转基因小鼠模型和/或与KO相关的小鼠KO小鼠分离的神经元中传感器的表达可以促进我们对与神经变性相关的早期细胞骨架功能障碍的分子基础的理解。
[背景]神经变性疾病的生化标志（神经原纤维，团块和缠结，提高活性氧物质（ROS） ...
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| CRISPR/Cas Gene Editing of a Large DNA Virus: African Swine Fever Virus
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Author:
Date:
2018-08-20
[Abstract] Gene editing of large DNA viruses, such as African swine fever virus (ASFV), has traditionally relied on homologous recombination of a donor plasmid consisting of a reporter cassette with surrounding homologous viral DNA. However, this homologous recombination resulting in the desired modified virus is a rare event. We recently reported the use of CRISPR/Cas9 to edit ASFV. The use of CRISPR/Cas9 to modify the African swine fever virus genome resulted in a fast and relatively easy way to introduce genetic changes. To accomplish this goal we first infect primary swine macrophages with a field isolate, ASFV-G, and transfect with the CRISPR/Cas9 donor plasmid along with a plasmid that will express a specific gRNA that targets our gene to be deleted. By inserting a reporter cassette, we are ...
[摘要] 大型DNA病毒（例如非洲猪瘟病毒（ASFV））的基因编辑传统上依赖于由报道盒组成的供体质粒与周围同源病毒DNA的同源重组。然而，这种导致所需修饰病毒的同源重组是罕见的事件。我们最近报道了使用CRISPR / Cas9编辑ASFV。使用CRISPR / Cas9修饰非洲猪瘟病毒基因组导致了引入遗传变化的快速且相对简单的方法。为了实现这一目标，我们首先用田间分离株ASFV-G感染原代猪巨噬细胞，并用CRISPR / Cas9供体质粒转染质粒，该质粒将表达靶向我们基因的特异性gRNA被删除。通过插入报告盒，我们能够通过有限稀释和噬菌斑纯化从亲本中纯化我们的重组病毒。我们以前曾报道将传统的同源重组方法与CRISPR / Cas9进行比较，结果导致重组增加超过4个对数。
【背景】 非洲猪瘟（ASF）是一种由ASF病毒（ASFV）引起的高度致命的猪传染性病毒性疾病。 ASFV的基因组由大约180-190千碱基对的双链DNA基因组组成。 ASFV引起一系列疾病，从高度致命到亚临床，取决于宿主特征和病毒株（Tulman et al。，2009）。 ASFV没有商业疫苗;实验上，2007年格鲁吉亚爆发的唯一能够抵御目前流行病毒株的疫苗（ASFV-G）是含有一个或多个病毒基因组缺失的减毒活疫苗，例如:( O'Donnell et ...
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| Ectopic Gene Expression in Macrophages Using in vitro Transcribed mRNA
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Author:
Date:
2018-05-20
[Abstract] Macrophages are immune cells that contribute to host defense through various mechanisms including phagocytosis and antigen presentation. Their antimicrobial capacity is subverted by clinically important intracellular pathogens such as Mycobacterium tuberculosis. The study of host-pathogen interactions using these cells is therefore of considerable interest. Such studies often seek to express tagged proteins to characterize their activities, localizations, and protein-protein interactions. Here, we describe a robust method for transient protein expression in macrophages using mRNA lipoplex transfections.
[摘要] 巨噬细胞是通过包括吞噬作用和抗原呈递在内的多种机制促成宿主防御的免疫细胞。 它们的抗菌能力被临床上重要的细胞内病原体诸如结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）所破坏。 因此使用这些细胞进行宿主 - 病原体相互作用的研究具有相当大的意义。 这样的研究通常试图表达标记的蛋白质来表征它们的活性，定位和蛋白质 - 蛋白质相互作用。 在这里，我们描述了使用mRNA脂质复合物转染在巨噬细胞中瞬时蛋白质表达的稳健方法。
【背景】典型的实现蛋白质表达的方法，包括使用阳离子聚合物转染DNA，核转染和病毒转导（Zhang等人，2009）在巨噬细胞中特别困难，因为这些细胞具有对 各种危险信号如胞质DNA。 因此，用于外源基因递送的常规方法导致差的转染效率和细胞死亡。 我们推论，正如最近的报道（Van De Parre等人，2004; McLenachan等人，2004）所述，转染mRNA而不是DNA，将是实现巨噬细胞中蛋白质表达的更好的替代方案 。，2013）。 我们能够实现高转染效率而不损失巨噬细胞活力（Koster等人，2017）。 我们的方法不需要昂贵的设备，可以适应表达外源性和内源性蛋白质。
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