{{'Search' | translate}}
 

T4 Polynucleotide Kinase

T4多核苷酸激酶

Company: New England Biolabs
Catalog#: M0201S
Bio-protocol()
Company-protocol()
Other protocol()

Method for CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Candida albicans
Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract]  Candida albicans is the most prevalent and important human fungal pathogen. The advent of CRISPR as a means of gene editing has greatly facilitated genetic analysis in C. albicans. Here, we describe a detailed step-by-step procedure to construct and analyze C. albicans deletion mutants. This protocol uses plasmids that allow simple ligation of synthetic duplex 23mer guide oligodeoxynucleotides for high copy gRNA expression in C. albicans strains that express codon-optimized Cas9. This protocol allows isolation and characterization of deletion strains within nine days. [摘要]  白色念珠菌是最普遍和最重要的人类真菌病原体。 CRISPR作为基因编辑手段的出现极大地促进了 C中的遗传分析。白色假丝酵母。 在这里,我们描述一个详细的分步过程来构建和分析 C。 白色念珠菌缺失突变体。 该协议使用质粒,允许合成的双链体23mer引导寡聚脱氧核苷酸在高拷贝gRNA表达的简单连接。 表达密码子优化的Cas9的白色念珠菌菌株。 该协议允许在9天内分离和鉴定缺失菌株。

【背景】℃。白色念珠菌是一种难以处理遗传的有机体。由于它通常作为不容易进行有性生殖的二倍体存在,所以纯合隐性突变需要对每个基因座进行连续修饰。克隆间规则间隔短回文重复(CRISPR)突变的发展和应用。白色念珠菌促进遗传操作,因为它允许两个等位基因同时突变(Vyas et al。,2015; Min et al。,2016; Ng and Dean,2017 )。 CRISPR基因编辑涉及将RNA引导的核酸酶募集至邻近NGG原型间隔子邻接基序(PAM)的互补靶位点(Jinek等人,2012; Cong等人, 2013年;马里等人,2013年)。 CRISPR相关(Cas)核酸酶通过与结合Cas9的激活CRISPR RNA(tracrRNA)相关的指导RNA之间的互补碱基配对以高特异性进行靶向(Gasiunas等人, ...

Coupling Exonuclease Digestion with Selective Chemical Labeling for Base-resolution Mapping of 5-Hydroxymethylcytosine in Genomic DNA
Author:
Date:
2018-03-05
[Abstract]  This protocol is designed to obtain base-resolution information on the level of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in CpGs without the need for bisulfite modification. It relies on (i) the capture of hydroxymethylated sequences by a procedure known as ‘selective chemical labeling’ (see Szulwach et al., 2012) and (ii) the digestion of the captured DNA by exonucleases. After Illumina sequencing of the digested DNA fragments, an ad hoc bioinformatic pipeline extracts the information for further downstream analysis. [摘要]  该协议旨在获得CpGs中5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)水平的碱基分辨率信息,而无需亚硫酸氢盐修饰。 它依赖于(i)通过称为“选择性化学标记”(参见Szulwach等人,2012)的方法捕获羟甲基化序列和(ii)通过外切核酸酶消化捕获的DNA。 在消化的DNA片段的Illumina测序之后,特设的生物信息学管道提取信息用于进一步的下游分析。

【背景】基因组DNA中胞嘧啶的甲基化可以被蛋白质读取,并且主要被翻译成基因沉默。基因组中的大多数CpG二核苷酸是甲基化的,包括位于基因调控区如增强子的那些。然而,当需要时,这些CpG可以通过Ten Eleven Translocation(TET)酶将甲基氧化并且通过碱基切除修复系统用未甲基化的胞嘧啶置换来去甲基化。 5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)是5-甲基胞嘧啶的第一个氧化衍生物,并且在基因组中绘制该修饰的碱基提供了关于正在进行活性去甲基化的区域的信息。尽管选择性化学标记(SCL)可以非常特异地检测5hmC,但该技术的分辨率受DNA片段大小的限制,特别是当捕获的DNA中存在多个CpG时。为了提高分辨率,我们引入了使用外切核酸酶的消化步骤,所述核酸外切酶将DNA分子修剪成靠近羟甲基化的胞嘧啶(Sérandour et。,2016)。然后对测序读数进行适当的生物信息学处理,然后将羟甲基化评分赋予捕获的CpG。

A Small RNA Isolation and Sequencing Protocol and Its Application to Assay CRISPR RNA Biogenesis in Bacteria
Author:
Date:
2018-02-20
[Abstract]  Next generation high-throughput sequencing has enabled sensitive and unambiguous analysis of RNA populations in cells. Here, we describe a method for isolation and strand-specific sequencing of small RNA pools from bacteria that can be multiplexed to accommodate multiple biological samples in a single experiment. Small RNAs are isolated by polyacrylamide gel electrophoresis and treated with T4 polynucleotide kinase. This allows for 3’ adapter ligation to CRISPR RNAs, which don’t have pre-existing 3’-OH ends. Pre-adenylated adapters are then ligated using T4 RNA ligase 1 in the absence of ATP and with a high concentration of polyethylene glycol (PEG). The 3’ capture step enables precise determination of the 3’ ends of diverse RNA molecules. Additionally, a random hexamer in the ligated ... [摘要]  新一代高通量测序技术能够对细胞中的RNA群体进行敏感和明确的分析。在这里,我们描述了一种从细菌中分离和链特异性测序小RNA池的方法,所述细菌可以在单个实验中多路复用以容纳多个生物样品。小RNA通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并用T4多核苷酸激酶处理。这允许3'衔接头连接至CRISPR RNA,其不具有预先存在的3'-OH末端。然后使用T4 RNA连接酶1在不存在ATP和高浓度聚乙二醇(PEG)的情况下将前腺苷酸化的衔接子连接。 3'捕获步骤能够精确测定不同RNA分子的3'末端。此外,连接适配器中的随机六聚体有助于控制潜在的下游扩增偏差。逆转录后,将cDNA产物环化并通过PCR制备文库。我们显示扩增的文库不需要通过凝胶电泳可见,以期望产物的有效测序。使用这种方法,我们通常从少量纯化的小RNA制备RNA测序文库。该协议适合于通过对成熟的CRISPR RNA进行测序来测定细菌中的CRISPR RNA生物合成,但可以用于测序不同类型的小RNA。我们还提供了一个完整的数据处理管道示例,并提供了运行所提供脚本的说明。


【背景】与聚集的经常散布的短回文重复序列(CRISPR)相关的遗传模块赋予不同的原核宿主适应性免疫(Barrangou et ...

Comments