| Guanine Nucleotide Exchange Assay Using Fluorescent MANT-GDP
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] GTPases are molecular switches that cycle between the inactive GDP-bound state and the active GTP-bound state. GTPases exchange nucleotides either by its intrinsic nucleotide exchange or by interaction with guanine nucleotide exchange factors (GEFs). Monitoring the nucleotide exchange in vitro, together with reconstitution of direct interactions with regulatory proteins, provides key insights into how a GTPase is activated. In this protocol, we describe core methods to monitor nucleotide exchange using fluorescent N-Methylanthraniloyl (MANT)-guanine nucleotide.
[摘要] GTP酶是分子开关，在无效GDP结合状态和活性GTP结合状态之间循环。 GTP酶通过其内在的核苷酸交换或通过与鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）的相互作用来交换核苷酸。 监测体外核苷酸交换，以及与调节蛋白直接相互作用的重构，为GTP酶如何被激活提供了重要见解。 在该协议中，我们描述了使用荧光N-甲基呋喃酰基（MANT） - 鸟嘌呤核苷酸来监测核苷酸交换的核心方法。
【背景】GTPase是鸟嘌呤核苷酸结合蛋白，调节细胞过程的广度，从蛋白质生物合成到细胞周期进展，从细胞骨架重组到膜运输。 GTPases可以被认为是分子开关，它在GDP结合“关闭”状态和GTP结合“开启”状态之间循环;在通过GTP的GDP核苷酸交换结合GTP时，GTP酶变得活跃并且将结合下游效应蛋白以招募和激活这些效应子的生物学功能。 GTP酶通过与开关I环（G2结构域）的高度保守苏氨酸和开关II环（G3结构域）的DxxG基序内的甘氨酸的相互作用结合GTP的γ-磷酸。 GTP水解后，与γ-磷酸相互作用的丧失导致动态构象变化，从而使GTPase变为关闭状态（Vetter and ...
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| Isolation and Analysis of Stromal Cell Populations from Mouse Lymph Nodes
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Author:
Date:
2017-08-20
[Abstract] Our protocol describes a simple procedure for isolating stromal cells from lymph nodes (LN). LN are disrupted then enzymatically digested with collagenase and dispase to produce a single cell suspension that can be stained with fluorescently labelled antibodies and analysed by flow cytometry. This protocol will enable identification of fibroblastic reticular cells (FRC), lymphatic endothelial cells (LEC), blood endothelial cells (BEC) as PNAd+ BEC that form LN high endothelial venules (HEV). This method can be applied to examine LN stromal cell responses during inflammatory events induced by infections or immunologic adjuvants and to subset most leukocytes found in LN.
[摘要] 我们的方案描述了从淋巴结（LN）分离基质细胞的简单过程。 LN被破坏，然后用胶原酶和分散酶酶消化以产生可以用荧光标记的抗体染色的单细胞悬浮液并通过流式细胞术分析。 该方案能够识别形成LN高内皮小静脉（HEV）的PNAd + BEC的成纤维细胞网状细胞（FRC），淋巴内皮细胞（LEC），血液内皮细胞（BEC）。 该方法可以用于检测由感染或免疫佐剂诱导的炎症事件期间的LN基质细胞反应，并且在LN中发现大多数白细胞。
【背景】淋巴结（LN）由间充质和内皮基质细胞的复杂网络构成。这些包括成纤维细胞网状细胞（FRCs），淋巴内皮细胞（LECs）和血液内皮细胞（BECs）。这些基质细胞组织了LN的复杂微结构，使得能够支持免疫细胞迁移，体内平衡，耐受性和细胞相互作用，以引发对病原体和肿瘤的免疫应答。我们已经表明，LN基质细胞可以响应于炎症信号而增殖和扩张，并且将免疫细胞募集到伴随感染的LN中（Gregory等，2017）。这些基质细胞也可以显着调节其转录程序以应对感染，从而支持持续的免疫应答。该方案使稳定状态和疾病期间LN的基质细胞亚群可靠地分离。这使得LN基质细胞的表型，功能，遗传或表观遗传学研究揭示了它们如何有助于组织体内平衡和免疫应答。
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| A High-throughput Assay for mRNA Silencing in Primary Cortical Neurons in vitro with Oligonucleotide Therapeutics
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Author:
Date:
2017-08-20
[Abstract] Primary neurons represent an ideal cellular system for the identification of therapeutic oligonucleotides for the treatment of neurodegenerative diseases. However, due to the sensitive nature of primary cells, the transfection of small interfering RNAs (siRNA) using classical methods is laborious and often shows low efficiency. Recent progress in oligonucleotide chemistry has enabled the development of stabilized and hydrophobically modified small interfering RNAs (hsiRNAs). This new class of oligonucleotide therapeutics shows extremely efficient self-delivery properties and supports potent and durable effects in vitro and in vivo. We have developed a high-throughput in vitro assay to identify and test hsiRNAs in primary neuronal cultures. To simply, rapidly, ...
[摘要] 原代神经元是鉴定用于治疗神经变性疾病的治疗性寡核苷酸的理想细胞系统。然而，由于原代细胞的敏感性，使用经典方法转染小干扰RNA（siRNA）是费力的，并且通常显示低效率。寡核苷酸化学的最新进展使得稳定和疏水修饰的小干扰RNA（hsiRNA）的发展成为可能。这种新型的寡核苷酸治疗剂显示出非常有效的自我传递性质，并且在体外和体内支持有效和持久的效果。我们开发了高通量的体外测定法来鉴定和测试原代神经元培养物中的hsiRNA。为了简单，快速，准确地量化数百个hsiRNA的mRNA沉默，我们使用QuantiGene 2.0定量基因表达测定法。这种高通量，96孔板测定法可以直接从样品裂解液中定量mRNA水平。在这里，我们描述了一种制备96孔板格式的小鼠原代皮质神经元的短期培养物用于寡核苷酸治疗剂的高通量测试的方法。该方法支持在短短两周内测试hsiRNA文库和鉴定潜在的治疗方法。我们详细介绍了从初级神经元准备到数据分析的高通量测定工作流程的方法。该方法可以帮助鉴定用于治疗各种神经疾病的寡核苷酸治疗剂。
【背景】寡核苷酸治疗剂代表了通过沉默突变蛋白的表达，可以靶向任何遗传定义的病症的新一类药物。具体地，siRNA是负载于RNA诱导的沉默复合体（RISC）中的双链寡核苷酸，并且可以在mRNA翻译之前使mRNA沉默。然而，未修饰的siRNA是不稳定的，并且不能在没有阳离子脂质制剂的帮助下进入细胞，其可能对原代细胞如神经元有毒性。在本协议中，我们使用自我递送，疏水修饰的siRNA（hsiRNA）进行mRNA沉默。最近在寡核苷酸化学方面的进展使得这些稳定的hsiRNA的设计促进了细胞内化，有效进入RISC以及有力击倒靶基因（Byrne等，2013; ...
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