| Generation and Implementation of Reporter BHK-21 Cells for Live Imaging of Flavivirus Infection
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Author:
Date:
2021-03-05
[Abstract] The genus Flavivirus within the family Flaviviridae includes many viral species of medical importance, such as yellow fever virus (YFV), Zika virus (ZIKV), and dengue virus (DENV), among others. Presently, the identification of flavivirus-infected cells is based on either the immunolabeling of viral proteins, the application of recombinant reporter replicons and viral genomes, or the use of cell-based molecular reporters of the flaviviral protease NS2B-NS3 activity. Among the latter, our flavivirus-activatable GFP and mNeptune reporters contain a quenching peptide (QP) joined to the fluorescent protein by a linker consisting of a cleavage site for the flavivirus NS2B-NS3 proteases (AAQRRGRIG). When the viral protease cleaves the linker, the quenching peptide is removed, and the ...
[摘要] [摘要]本属黄病毒家族中的黄病毒包括医学重要性许多病毒种类，如黄热病病毒（YFV），寨卡病毒（ZIKV）和登革热病毒（DENV），等等。目前，黄病毒感染细胞的鉴定是基于病毒蛋白的免疫标记，重组报告子复制子和病毒基因组的应用，或黄病毒蛋白酶NS2B-NS3活性的基于细胞的分子报告子的使用。在后者中，我们的黄病毒可激活的GFP和mNeptune报道分子含有通过接头连接到荧光蛋白的淬灭肽（QP），该接头由黄病毒NS2B - NS3蛋白酶（AAQRRGRIG）的切割位点组成。当病毒蛋白酶切割接头时，淬灭肽被去除，并且荧光蛋白采用促进荧光的构象。在这里，我们提供了用于表达，选择和实施表达黄病毒基因编码分子报告子的稳定BHK-21细胞的详细协议，适用于通过活细胞成像监测病毒感染。我们还将描述图像分析过程并提供所需的软件管道。我们的报告细胞允许通过活细胞成像对黄病毒的参考菌株和天然菌株实施单细胞感染动力学以及噬菌斑测定。
图形摘要：
黄病毒感染实时成像的报告基因BHK-21细胞的产生与实施工作流。
[背景]黄病毒代表了正在引起并正在重新出现的全球性威胁，可能引起动物和人类疾病，包括许多与医学有关的病毒，例如黄热病病毒（YFV），西尼罗河病毒（WNV），日本脑炎病毒（JEV），登革热病毒（DENV），并兹卡六RUS（ZIKV），等等（摹·乌尔德·所罗门，2008） ...
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| Multiplex T-cell Stimulation Assay Utilizing a T-cell Activation Reporter-based Detection System
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Author:
Date:
2021-01-20
[Abstract] Immune tolerance and response are both largely driven by the interactions between the major histocompatibility complex (MHC) expressed by antigen presenting cells (APCs), T-cell receptors (TCRs) on T-cells, and their cognate antigens. Disordered interactions cause the pathogenesis of autoimmune diseases such as type 1 diabetes. Therefore, the identification of antigenic epitopes of autoreactive T-cells leads to important advances in therapeutics and biomarkers. Next-generation sequencing methods allow for the rapid identification of thousands of TCR clonotypes from single T-cells, and thus there is a need to determine cognate antigens for identified TCRs. This protocol describes a reporter system of T-cell activation where the fluorescent reporter protein ZsGreen-1 is driven by nuclear ...
[摘要] [摘要] 免疫耐受和应答都很大程度上由抗原呈递细胞（APC）表达的主要组织相容性复合物（MHC），T细胞上的T细胞受体（TCR）及其同源抗原之间的相互作用驱动。相互作用障碍导致自身免疫性疾病（例如1型糖尿病）的发病机理。因此，鉴定自身反应性T细胞的抗原表位导致治疗和生物标志物的重要进展。下一代测序方法可从单个T细胞快速鉴定数千种TCR克隆型，因此需要确定已鉴定TCR的同源抗原。该协议描述了T细胞活化的报告系统，其中荧光报告蛋白ZsGreen-1由活化T细胞的核因子（NFAT）信号驱动并通过流式细胞仪读取。记者T细胞也组成性表达额外的一对荧光素tein作为识别物，允许同时多路复用多达8种不同的报告T细胞系，每种表达不同的目标TCR，可通过流式细胞仪区分。一旦制成TCR表达细胞系，仅需一个转导步骤即可将其无限期用于制备新的T细胞系。这种多路复用系统允许筛选TCR-抗原相互作用的数量，否则这些相互作用将是不切实际的，可在多种情况下使用（即，筛选单个抗原或抗原库），并可用于研究任何T细胞-MHC-抗原三分子相互作用。
[背景] T细胞，抗原呈递细胞（APC）及其同源抗原之间的相互作用是自身免疫性疾病（例如1型糖尿病）的主要事件（Michels等，2017； ...
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| Screening Method for CRISPR/Cas9 Inhibition of a Human DNA Virus: Herpes Simplex Virus
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Author:
Date:
2020-09-05
[Abstract] The efficiency of cleavage of individual CRISPR/Cas9-sgRNAs remains difficult to predict based on the CRISPR target sequence alone. Different intracellular environments (dependent on cell type or cell cycle state for example) may affect sgRNA efficiency by altering accessibility of genomic DNA through DNA modifications such as epigenetic marks and DNA-binding proteins (e.g., histones) as well as alteration of the chromatin state of genomic DNA within the nucleus.
We recently reported a multi-step screening method for the identification of efficient sgRNAs targeting the Herpes simplex virus (HSV-1) genome and reported a differential mechanism for viral inhibition by CRISPR-Cas9 in the latent versus lytic phase. The screening platform detailed in this protocol allows ...
[摘要] [摘要 ] 单独基于CRISPR靶序列仍难以预测单个CRISPR / Cas9-sgRNA的切割效率。不同的细胞内环境（例如，取决于细胞类型或细胞周期状态）可能会通过DNA修饰（例如表观遗传标记和DNA结合蛋白（例如组蛋白））和染色质状态的改变来改变基因组DNA的可及性，从而影响sgRNA效率。核内基因组DNA的标记。
我们recen TLY 报道的多步骤方法筛选用于有效sgRNAs靶向的识别的单纯疱疹病毒（HSV-1）的基因组，并报告为在潜对裂解病毒相抑制CRISPR-Cas9的差动机构。该协议中详述的筛选平台允许在无细胞系统中以及在病毒靶细胞（例如人包皮成纤维细胞）的背景下逐步测试切割效率，然后对CRISPR / sgRNA的作用进行功能测试病毒蛋白的表达，复制，和再活化。该策略可以容易地应用于其他靶细胞，例如多能干细胞衍生的人感觉神经元或其他人DNA病毒。
背景 ] 单纯疱疹病毒（HSV）是的一种嗜神经性DNA病毒疱疹病毒科家族引起终身和无法治愈感染在大多数人群的，并可能导致显著发病率和死亡率（Liesegang环等人，1989; Roizman 等人。，2013） ...
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