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HEPES (1 M)

HEPES (1μM)

Company: Thermo Fisher Scientific
Catalog#: 15630080
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FACS-based Isolation of Neural and Glioma Stem Cell Populations from Fresh Human Tissues Utilizing EGF Ligand
Author:
Date:
2017-12-20
[Abstract]  Direct isolation of human neural and glioma stem cells from fresh tissues permits their biological study without prior culture and may capture novel aspects of their molecular phenotype in their native state. Recently, we demonstrated the ability to prospectively isolate stem cell populations from fresh human germinal matrix and glioblastoma samples, exploiting the ability of cells to bind the Epidermal Growth Factor (EGF) ligand in fluorescence-activated cell sorting (FACS). We demonstrated that FACS-isolated EGF-bound neural and glioblastoma populations encompass the sphere-forming colonies in vitro, and are capable of both self-renewal and multilineage differentiation. Here we describe in detail the purification methodology of EGF-bound (i.e., EGFR+) human neural and ... [摘要]  从新鲜组织中直接分离人类神经和胶质瘤干细胞允许其在没有事先培养的情况下进行生物学研究,并且可以在其天然状态中捕获其分子表型的新方面。最近,我们展示了前瞻性地从新鲜人类生发基质和胶质母细胞瘤样品中分离干细胞群的能力,利用细胞在荧光激活细胞分选(FACS)中结合表皮生长因子(EGF)配体的能力。我们证明FACS分离的EGF结合的神经和成胶质细胞瘤细胞群体在体外包含球体形成的集落,并且能够自我更新和多向分化。在此我们详细描述了具有来自新鲜死亡和手术组织的干细胞特性的EGF-结合(即EGFR +)人类神经和胶质瘤细胞的纯化方法。利用天然配体结合能力前瞻性分离干细胞群的能力为了解非培养条件下的正常和肿瘤细胞生物学打开了新的门,并且适用于在种群和单细胞分辨率下的各种下游分子测序研究。

【背景】由于缺乏通用的神经和神经胶质瘤干细胞标志物(Lathia et al。,2015)以及频繁依赖于培养的细胞,理解人神经和胶质瘤干细胞的内在生物学一直是一个挑战比那些直接从组织分离的。跨膜糖蛋白Prominin或CD133是分离神经(Uchida等,2000)和神经胶质瘤干细胞(GSC)(Singh等,2000)的最好描述和经常使用的干细胞标记物之一。等人,2003; Singh等人,2004; ...

A Novel Protocol to Quantitatively Measure the Endocytic Trafficking of Amyloid Precursor Protein (APP) in Polarized Primary Neurons with Sub-cellular Resolution
Author:
Date:
2017-12-05
[Abstract]  Alzheimer’s disease’s established primary trigger is β-amyloid (Aβ) (Mucke and Selkoe, 2012). The amyloid precursor protein (APP) endocytosis is required for Aβ generation at early endosomes (Rajendran and Annaert, 2012). APP retention at endosomes depends on its sorting for degradation in lysosomes (Haass et al., 1992; Morel et al., 2013; Edgar et al., 2015; Ubelmann et al., 2017). The following endocytosis assay has been optimized to assess the amyloid precursor protein (APP) endocytosis and degradation by live murine cortical primary neurons (Ubelmann et al., 2017). [摘要]  阿尔茨海默病确定的主要触发因素是β-淀粉样蛋白(Aβ)(Mucke和Selkoe,2012)。 淀粉样蛋白前体蛋白(APP)内吞作用是在早期内体中产生Aβ所必需的(Rajendran和Annaert,2012)。 内涵体上的APP保留取决于其对溶酶体中的降解的分选(Haass等人,1992; Morel等人,2013; Edgar等人, 2015年; Ubelmann等人,2017年)。 已经优化了以下内吞作用测定法以评估活的小鼠皮层原代神经元的淀粉状蛋白前体蛋白(APP)内吞作用和降解(Ubelmann等人,2017)。

【背景】Aβ42积聚是阿尔茨海默病的主要触发因素。 APP的胞吞作用需要Aβ42代(辜和Squazzo,1994; Grbovic 等人,2003; Cirrito 等人,2008;拉金德伦等人,2008)。已经通过表面蛋白的经典生物素化在脉冲追踪动力学实验中分析了APP的内吞作用(Sannerud等人,2011; Xiao等人,2012; Sullivan等人,2014),在单细胞中通过使用针对APP的N-末端胞外结构域的抗体(Yamazaki等人,1995; Xiao ,2012)。这些研究中的大多数使用非神经元细胞(Yamazaki等人,1996; Lee等人,2008; Sullivan等人, ...

Measuring the Endocytic Recycling of Amyloid Precursor Protein (APP) in Neuro2a Cells
Author:
Date:
2017-12-05
[Abstract]  The established primary trigger of Alzheimer’s disease’s is β-amyloid (Aβ) (Mucke and Selkoe, 2012). Amyloid precursor protein (APP) endocytosis is required for Aβ generation at early endosomes (Rajendran and Annaert, 2012). APP retention at endosomes also depends on its recycling back to the plasma membrane (Koo et al., 1996; Ubelmann et al., 2017). The following recycling assay has been optimized to assess APP recycling by live murine Neuro2a cells, a neuroblastoma cell line (Ubelmann et al., 2017). [摘要]  已确定的阿尔茨海默病的主要诱因是β-淀粉样蛋白(Aβ)(穆克和Selkoe,2012)。淀粉样蛋白前体蛋白(APP)胞吞作用是早期内涵体产生Aβ所必需的(核内体中的APP保留还取决于其回到质膜的再循环(Koo等人,1996; Rajendran和Annaert,2012)。 Ubelmann等人,2017)。已经优化了以下回收测定法以评估活的小鼠神经母细胞瘤细胞系具有Neuro2a细胞(Ubelmann等人,2017)的APP回收。

【背景】Aβ42积聚是阿尔茨海默病的主要触发因素,APP的胞吞作用需要Aβ42代(辜和Squazzo,1994; Grbovic等人,2003; Cirrito等人,2008;拉金德伦等人,2008)内吞作用后,APP可以循环回到质膜上,可能会逃避内体的处理虽然许多研究表征了APP内吞作用,但需要建立调节。 APP回收的机制。因此,强有力的,敏感的和定量的测定是必要的。已经通过免疫荧光和定量地使用表面蛋白的批量生物素化,随后追逐内吞作用和剥离或阻断表面蛋白后的循环追踪,定性地评估APP回收(辜等,1996; Yamazaki,1996; Chaufty等,2012)。
 
我们使用经典的免疫荧光和半定量的细胞生物学方法,开发了用于跟踪和测量具有Neuro2a细胞中的APP回收的方法。我们的测定依赖于用红色荧光蛋白(RFP)标记的APP的瞬时表达,以检测和定量APP的细胞库和使用针对APP胞外域的抗体来选择性检测和定量表面池的运输的APP。 ...

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