| Assay to Measure Interactions between Purified Drp1 and Synthetic Liposomes
|
|
Author:
Date:
2017-05-05
[Abstract] A mitochondrion is a dynamic intracellular organelle that actively divides and fuses to control its size, number and shape in cells. A regulated balance between mitochondrial division and fusion is fundamental to the function, distribution and turnover of mitochondria (Roy et al., 2015). Mitochondrial division is mediated by dynamin-related protein 1 (Drp1), a mechano-chemical GTPase that constricts mitochondrial membranes (Tamura et al., 2011). Mitochondrial membrane lipids such as phosphatidic acid and cardiolipin bind Drp1, and Drp1-phospholipid interactions provide key regulatory mechanisms for mitochondrial division (Montessuit et al., 2010; Bustillo-Zabalbeitia et al., 2014; Macdonald et al., 2014; Stepanyants et al., 2015; ...
[摘要] 线粒体是一种动态的细胞内细胞器，主动分裂和融合以控制细胞的大小，数量和形状。线粒体分裂和融合之间的调节平衡是线粒体功能，分布和周转的基础（Roy等，2015）。线粒体分化是由动力蛋白相关蛋白1（Drp1）介导的，其是限制线粒体膜的机械化学GTP酶（Tamura等人，2011）。线粒体膜脂质如磷脂酸和心磷脂结合Drp1，并且Drp1磷脂相互作用提供线粒体分裂的关键调控机制（Montessuit等人，2010; Bustillo-Zabalbeitia等人2014年; Macdonald等人，2014年; Stepanyants等人，2015; Adachi等人，2016）。在这里，我们描述了使用纯化的重组Drp1和具有定义的一组磷脂的合成脂质体定量测量Drp1与脂质的相互作用的生物化学实验。该测定使得可以定义蛋白质 - 脂质相互作用的特异性以及头基和酰基链的作用。
背景 蛋白质和膜脂质的相互作用对于细胞如细胞器分裂中生物膜的重塑至关重要。在线粒体分裂中，Drp1限制线粒体膜并驱动该膜重塑过程。我们最近显示，信号磷脂，磷脂酸与Drp1相互作用，并通过限制线粒体上的组装分裂机制（Adachi等人，2016）产生启动步骤。 Drp1识别磷脂酸的头基和酰基链。为了分析Drp1-磷脂酸结合，我们建立了几种蛋白质 - ...
|
|
|
| Expression and Purification of Mini G Proteins from Escherichia coli
|
|
Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] Heterotrimeric G proteins modulate intracellular signalling by transducing information from cell surface G protein-coupled receptors (GPCRs) to cytoplasmic effector proteins. Structural and functional characterisation of GPCR–G protein complexes is important to fully decipher the mechanism of signal transduction. However, native G proteins are unstable and conformationally dynamic when coupled to a receptor. We therefore developed an engineered minimal G protein, mini-Gs, which formed a stable complex with GPCRs, and facilitated the crystallisation and structure determination of the human adenosine A2A receptor (A2AR) in its active conformation. Mini G proteins are potentially useful tools in a variety of applications, including characterising GPCR ...
[摘要] 异源三聚体G蛋白通过将细胞表面G蛋白偶联受体（GPCR）的信息转导至细胞质效应蛋白来调节细胞内信号传导。 GPCR-G蛋白复合物的结构和功能表征对于完全破译信号转导机制是重要的。然而，当与受体偶联时，天然G蛋白质是不稳定的并具有构象的动力学。因此，我们开发了一种工程化的最小G蛋白，其与GPCR形成稳定的复合物，促进了人腺苷A 2A受体的结晶和结构测定（A 2AR）的活性构象。 Mini G蛋白是各种应用中潜在有用的工具，包括表征GPCR药理学，结合亲和力和动力学实验，激动剂药物发现和GPCR-G蛋白复合物的结构测定。在这里，我们描述了一个用于表达和纯化mini-G 的详细方案。
我们最近报告了一种工程化的最小G蛋白质（Carpenter和Tate，2016）的开发，其促进了人腺苷A 2A受体的结晶（ A 2 R 2）其活性构象（Carpenter等人，2016; Carpenter和Tate，2017）。不同于需要在真核系统中表达的异源三聚体G蛋白质，在大肠杆菌（大肠杆菌）中高度表达微型G蛋白，并且可以可以容易地纯化，每升培养物的产量为50-100mg的mini-G 。在这里，我们描述了早先在Carpenter和Tate（2016）中描述的可以用于前面描述的任何一种迷你G蛋白构建体的表达和纯化的逐步方案（Carpenter等人， ...
|
|
|
| Investigating the Assembly Status of the Plastid Encoded Polymerase Using BN-PAGE and Sucrose Gradient Centrifugation
|
|
Author:
Date:
2016-07-20
[Abstract] The plastid encoded polymerase (PEP) represents a major transcription machinery in mature chloroplasts (Liere et al., 2011; Zhelyazkova et al., 2012). The proper assembly of this multi-subunit complex is important for plant growth and development (Pfalz and Pfannschmidt, 2013). The PEP polymerase can be purified from soluble and from membrane-bound (also named transcriptionally active chromosome, TAC) fractions. Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and sucrose gradient sedimentation followed by immunoblot analyses is used to detect the status of the PEP complex assembly.
[摘要] 质体编码聚合酶（PEP）代表成熟叶绿体中的主要转录机制（Liere等人，2011; Zhelyazkova等人，2012）。 这种多亚基复合物的正确装配对于植物生长和发育是重要的（Pfalz和Pfannschmidt，2013）。 PEP聚合酶可以从可溶性和膜结合（也称为转录活性染色体，TAC）级分中纯化。 蓝色使用天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）和蔗糖梯度沉淀，随后进行免疫印迹分析来检测PEP复合物组装体的状态。
|
|
|