| Generation of Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) Using Polyacrylamide Gels
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Author:
Date:
2020-11-05
[Abstract] Giant unilamellar vesicles (GUVs) are a widely used model system for a range of applications including membrane biophysics, drug delivery, and the study of actin dynamics. While several protocols have been developed for their generation in recent years, the use of these techniques involving charged lipid types and buffers of physiological ionic strength has not been widely adopted. This protocol describes the generation of large numbers of free-floating GUVs, even for charged lipid types and buffers of higher ionic strength, using a simple approach involving soft polyacrylamide (PAA) gels. This method entails glass cover slip functionalization with (3-Aminopropyl)trimethoxysilane (APTES) and glutaraldehyde to allow for covalent bonding of PAA onto the glass surface. After polymerization ...
[摘要] [摘要]巨型单层囊泡（GUV）是一种广泛使用的模型系统，其应用范围包括膜生物物理学，药物递送以及肌动蛋白动力学研究。虽然一些协议已经为他们这一代人在最近几年已开发，利用这些T的echniques涉及带电脂质的类型和生理离子强度缓冲液一直没有得到广泛的广告Ø PTED。Thi的方案描述了使用包括聚丙烯酰胺（PAA）凝胶的简单方法，即使对于带电荷的脂质类型和更高离子强度的缓冲液，也产生了大量的自由浮动GUV。此方法需要使用（3-氨基丙基）三甲氧基硅烷（APTES）和戊二醛对玻璃盖玻片进行功能化，以允许将PAA共价键合到玻璃表面上。PAA聚合后，将凝胶真空干燥。随后，将选择的脂质均匀地分散在干燥的凝胶表面上，并且可以使用具有不同离子强度的缓冲液来重新水化凝胶并形成GUV。该协议对于在生理条件下生产大量由不同脂质组成的自由浮动GUV而言是可靠的。它可以方便地用常用的实验室试剂进行。
[背景】虽然温和的水化和电铸是两个巨的最常用的方法单层囊泡（GUV）的形成，只有少数研究，报告其使用带电脂质类型和斯坦因的生理离子强度缓冲液（等人。，2017; ...
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| Analyzing (Re)Capping of mRNA Using Transcript Specific 5' End Sequencing
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Author:
Date:
2020-10-20
[Abstract] The 5′ cap is a ubiquitous feature of eukaryotic mRNAs. It is added in the nucleus onto newly synthesized pre-mRNA, and in the cytoplasm onto mRNAs after decapping or endonuclease cleavage. Cytoplasmic recapping can occur after loss of the cap at the native 5′ end, or downstream within the body of the mRNA. The identification and location of recapping events is key to understanding the functional consequences of this process. Here we present an approach that addresses this problem, using the Lexogen TeloPrime® cDNA synthesis kit to tag recapped 5′ ends. TeloPrime uses a proprietary DNA ligase to add a double stranded DNA oligonucleotide onto the 3′ end of cDNA while it is base paired with mRNA. Specificity for capped ends is obtained by the oligonucleotide having an unpaired C ...
[摘要] [摘要]5′cap是真核mRNAs普遍存在的特征。它被添加到新合成的pre-mRNA的细胞核中，并在去盖或核酸内切酶切割后加入到mRNAs的细胞质中。细胞质重拾可发生在5′端或mRNA体下游的cap缺失后。识别和定位重述事件是理解该过程的功能后果的关键。这里我们提出了一种解决这个问题的方法，使用Lexogen TeloPrime®cDNA合成试剂盒来标记重述的5′端。TeloPrime使用一种专有的DNA连接酶，在cDNA的3′端加入一个双链DNA寡核苷酸，同时与mRNA碱基配对。寡核苷酸在mRNA 5′端有一个与m7G弱碱基配对的不成对C残基。然后用引物对附加的寡核苷酸和感兴趣的mRNA进行双链cDNA的PCR扩增。得到的产物是凝胶纯化和直接测序（如果是单个带）或克隆和测序。连接的寡核苷酸和靶mRNA连接处的序列提供了cap在相应转录物上的位置。此方法适用于所有封顶转录本。它可以与Sanger测序一起用于少量的转录物，也可以用于Illumina库测序。
[背景]N7-甲基鸟苷帽是所有真核mRNAs的一个显著特征。与cap结合的蛋白质在mRNA生命周期的各个阶段发挥作用，包括核加工、输出、翻译和mRNA衰变。5′cap以共转录方式添加到所有mRNAs中，并开发了许多全基因组技术（例如，基因表达的Capped分析，或CAGE）（Morioka等人，2020年），这些技术利用末端末端的鉴定来标记转录起始位点。除了标记转录起始位点外，约25%的笼状标签映射到剪接内含子的下游（Djebali等人，2012年）。生物化学基础的证据来自我们实验室2009年的鉴定：一种细胞质复合体能够将N7甲基鸟苷帽恢复到5′-单磷酸末端的转录物上，但不能恢复到5′-羟基末端的转录物上（Otsuka等人，2009年）。细胞质封顶由一种复合酶催化，包括封盖酶（RNGTT）、帽甲基转移酶（RNMT）及其激活亚单位（RAM），以及一种将去盖转录物的5′-单磷酸末端转化为5′-二磷酸底物以进行GMP添加的激酶（Trotman和Schoenberg，2019）。我们的早期工作是基于在GMP添加步骤中阻断细胞质封盖的显性负型封盖酶的使用。该蛋白的表达导致出现许多未封顶的转录本，其末端使用5'-种族定位到下游笼状标签附近（Kiss等人，2015年；Berger等人，2019年）。虽然令人鼓舞，但这种方法有三个主要缺点：a）它需要分离带帽和未封顶的rna，b）它假设未封顶的转录本保持足够稳定，可以被检测到，以及c）它假设以这种方式检测到的未封顶末端经历了有限的额外的核外溶核修剪。 ...
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| A Detailed and Radioisotope-free Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)
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Author:
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2020-08-20
[Abstract] To comprehensively characterize the functions of a transcription factor (TF), it is required to analyze the interaction of this TF with its targeted loci. Several methods such as β-glucuronidase (GUS) or luciferase reporter, yeast one-hybrid (Y1H), chromatin-immunoprecipitation (ChIP), and electrophoretic mobility shift assay (EMSA) assays have been developed. Of these, EMSA is an in vitro method which can prove the direct interaction between TF and targeted DNA fragment. In the present protocol, DNA probes are labeled with Biotin. Therefore, it is safer for researchers when they do not need to use radioisotope-labeled probes. In addition, this protocol is to provide a detailed procedure for a successful EMSA assay. The interested recombinant protein can be mixed with ...
[摘要] [摘要] 为了全面表征转录因子（TF）的功能，需要分析该TF与目标基因座的相互作用。已经开发了几种方法，例如β-葡萄糖醛酸苷酶（GUS）或荧光素酶报道基因，酵母单杂交（Y1H），染色质免疫沉淀（ChIP ）和电泳迁移率变动分析（EMSA）分析。其中，EMSA是体外的 可以证明TF与目标DNA片段之间直接相互作用的方法。在本协议中，DNA探针用生物素标记。因此，当研究人员不需要使用放射性同位素标记的探针时，它更安全。此外，该协议还将为成功的EMSA分析提供详细的程序。可以将感兴趣的重组蛋白与靶向DNA探针混合，以在室温（25°C）下进行结合反应。之后，反应混合物可以在天然聚丙烯酰胺凝胶中运行，并转移到带正电的尼龙膜上。最后，可以通过生物素-链霉亲和素化学发光检测结果并可视化。
[背景 ] EMSA是检测蛋白（之间的直接相互作用的有效方法例如，转录因子）和DNA片段（陈，2011）。通常，与蛋白质结合的DNA探针的移动速度比凝胶中的游离DNA探针的移动速度慢。可以观察到这种蛋白质-DNA复合物的移动带移位，而游离DNA探针向凝胶底部的移动速度更快。基于此特征，可以用放射性同位素[ 例如Phosphorus-32（32 ...
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