| Preparation of Synaptoneurosomes to Study the Synapse in the Murine Cerebral Cortex
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Author:
Date:
2021-01-20
[Abstract] The synapse is a complex structure where the transmission of information takes place. Synaptic dysfunction is one of the earliest pathophysiological events in several diseases, such as traumatic brain injury, cerebral ischemia, and neurodegenerative diseases. Thus, a methodology to study synaptic structure and function is crucial for the development of potential strategies for the treatment of many neurological diseases. Synaptoneurosomes (SNs) are structures assembled by the sealed presynaptic bouton and the attached post-synaptic density. Despite the fact that for a long time it has been recognized that SNs are a powerful tool to study synaptic function, composition, and structure, its use has been limited by the requirement of relatively large amounts of material to successfully ...
[摘要] [摘要]突触是一个复杂的结构，在此结构中发生信息的传递。小号ynaptic功能障碍是几种疾病，如脑外伤，脑缺血最早的病理生理活动之一，和神经退行性疾病。因此，研究突触结构和功能的方法学对于开发治疗许多神经系统疾病的潜在策略至关重要。突触神经小体（SN）是由密封的突触前钮扣和附加的突触后密度组装而成的结构。尽管很长一段时间以来，人们已经认识到SN是研究突触功能，组成的强大工具，在结构和结构上，其使用受到成功地隔离它们所需的相对大量材料的限制。在这里，我们描述了在低渗条件下执行的三步离心程序，以从少量大脑皮层中分离出SN。
图形摘要：
突触神经体的制备流程图。
[背景]突触是由连接至突触后终端和突触前布顿组装的结构所包围由星形细胞伸长率（Halassa等人，2007 ）。在过去的十年中，见证了许多用于研究其结构和功能的高度复杂的技术的发展。但是，SN仍被大量研究者所使用，因为它们相对容易分离并产生有关突触结构和功能的有价值的信息。SNs的制备是在特定的低渗条件下进行的改良的细胞分离程序，可分离突触前突突和附着的突触后元件。在鉴定的最初阶段，它们被称为无细胞响应制剂，因为它们对激素具有响应（Chasin等，197 4 ；Horn和Phillipson ，1976 ...
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| Native Co-immunoprecipitation Assay to Identify Interacting Partners of Chromatin-associated Proteins in Mammalian Cells
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Author:
Date:
2020-12-05
[Abstract] Protein-protein interactions play key roles in nuclear processes including transcription, replication, DNA damage repair, and recombination. Co-immunoprecipitation (Co-IP) followed by western blot or mass spectrometry is an invaluable approach to identify protein-protein interactions. One of the challenges in the Co-IP of a protein localized to nucleus is the extraction of nuclear proteins from sub-nuclear fractions without losing physiologically relevant protein interactions. Here we describe a protocol for native Co-IP, which was originally used to successfully identify previously known as well novel topoisomerase 1 (TOP1) interacting proteins. In this protocol, we first extracted nuclear proteins by sequentially increasing detergent and salt concentrations, the extracted fractions were ...
[摘要] [摘要]蛋白质间相互作用 在核过程中起关键作用，包括转录，复制，DNA损伤修复和重组。免疫共沉淀（Co-IP），然后进行蛋白质印迹或质谱分析是鉴定蛋白质-蛋白质相互作用的宝贵方法。在Co-IP中定位于细胞核的蛋白质中的挑战之一是从亚核级分中提取核蛋白质，而又不会失去生理上相关的蛋白质相互作用。在这里，我们描述了一种用于天然Co-IP的协议，该协议最初用于成功地识别以前称为新拓扑拓扑异构酶1（TOP1）相互作用的蛋白质。在此协议中，我们首先通过依次增加去污剂和盐浓度来提取核蛋白，然后将提取的级分稀释，合并并用于Co-IP。该协议可用于鉴定多种哺乳动物细胞中其他染色质相关蛋白的蛋白相互作用组。
背景]钴- IP被广泛地被使用，以解开的错综复杂的关系之间的蛋白复合物和各种染色质交易期间的复制，转录，和基因组的维护。但是，它是具有挑战性的，以保持不稳定的蛋白质-蛋白质相互作用的完整过程中提取，免疫沉淀和一个共同的IP实验的洗涤步骤。稳定不稳定蛋白质相互作用的一种方法是在细胞裂解之前用细胞可渗透的可逆化学交联剂（例如丙酸二硫代双琥珀酰亚胺酯）处理细胞（Smith等人，2011）。由于该方法伴随着诸如提取效率低和非特异性蛋白质捕获之类的缺点，因此优选不交联的Co-IP（天然IP）。
一核蛋白质可以被分配到不同的子-核舱或染色质区域是需要不同程度的严格性为它的提取和溶解。对于例如，TOP ...
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| In vitro Enzymatic Assays of Histone Decrotonylation on Recombinant Histones
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Author:
Date:
2018-07-20
[Abstract] Class I histone deacetylases (HDACs) are efficient histone decrotonylases, broadening the enzymatic spectrum of these important (epi-)genome regulators and drug targets. Here, we describe an in vitro approach to assaying class I HDACs with different acyl-histone substrates, including crotonylated histones and expand this to examine the effect of inhibitors and estimate kinetic constants.
[摘要] I类组蛋白去乙酰化酶（HDACs）是有效的组蛋白去蛋白酶，拓宽了这些重要（epi-）基因组调节因子和药物靶标的酶谱。 在这里，我们描述了一种体外方法来测定具有不同酰基 - 组蛋白底物的I类HDAC，包括巴豆酰化组蛋白，并将其扩展以检查抑制剂的作用并估计动力学常数。
【背景】组蛋白的翻译后修饰是基因组调控的重要方面，包括基因表达（例如参见Pengelly et al。，2013;在Castillo 等人中综述，2017）。组蛋白修饰改变染色质结构和/或调节蛋白质的结合，例如核小体重塑因子（在Bannister和Kouzarides，2011中综述）。大多数组蛋白修饰是可逆的并且可以酶促去除。例如，通过组蛋白脱乙酰基酶（HDAC）除去组蛋白乙酰化，其中存在几类。近年来，新的组蛋白赖氨酸酰化，包括琥珀酰化，丙酰化，丁酰化，羟基丁基化和巴豆酰化已成为规范组蛋白乙酰化的新替代物，并且已经证实了许多这些新发现的组蛋白修饰的功能相关性（Sabari 等人，2017）。特别是，组蛋白巴豆酰化与活性基因表达有关，并被认为受细胞代谢状态的影响（Sabari et al。，2015; Fellows et al。 ，2018年）。最近已显示I类组蛋白脱乙酰酶也有效地去除组蛋白质（Wei et al。，2017; Fellows et al。，2018）。
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