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HEPES

HEPES

Company: Sigma-Aldrich
Catalog#: H4034
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HCV Reporter System (Viral Infection-Activated Split-Intein-Mediated Reporter System) for Testing Virus Cell-to-cell Transmission ex-vivo
Author:
Date:
2018-08-05
[Abstract]  Hepatitis C virus (HCV) spread involves two distinct entry pathways: cell-free transmission and cell-to-cell transmission. Cell-to-cell transmission is not only an efficient way for viruses to spread but also an effective method for escaping neutralizing antibodies. We adapted the viral infection-activated split-intein-mediated reporter system (VISI) and developed a straightforward model for Live-cell monitoring of HCV cell-to-cell transmission ex-vivo: co-culture of HCV infected donor cells (red signal) with uninfected recipient cells (green signal) and elimination of the cell-free transmission by adding potent neutralizing antibody AR3A in the supernatant. With this model, the efficiency of cell-to-cell transmission can be evaluated by counting the number of foci designated by ... [摘要]  丙型肝炎病毒(HCV)传播涉及两种不同的进入途径:无细胞传播和细胞间传播。 细胞间传播不仅是病毒传播的有效方式,也是逃避中和抗体的有效方法。 我们采用了病毒感染激活的分裂 - 内含肽介导的报告系统(VISI),并开发了一种直接模型,用于活细胞监测HCV细胞间传递离体:共培养 HCV感染的供体细胞(红色信号)与未感染的受体细胞(绿色信号)和通过在上清液中加入有效的中和抗体AR3A消除无细胞的传递。 利用该模型,可以通过计数受体细胞的绿色信号指定的病灶数来评估细胞间传递的效率。

【背景】越来越多的证据证明病毒可以在受感染的组织中使用不同的传播途径(Sattentau,2008; Zhong et al。,2013)。对于HCV传播,无细胞传播和细胞间传播均可介导肝细胞之间的病毒转移。虽然无细胞传播引发HCV感染,但认为细胞 - 细胞传递直接将HCV转移至相邻的肝细胞。它提供了抵抗中和抗体并有助于病毒持久性的极好方法(Brimacombe et al。,2011; Xiao et al。,2014)。之前的文章也证明了一些促进细胞传递的宿主因子,如清道夫受体BI(SR-BI),CD81,紧密连接蛋白claudin-1(CLDN1),Occludin(OCLN),表皮生长因子受体(EGFR)。 (Witteveldt et al。,2009; ...

Fluorescent Labeling of Rat-tail Collagen for 3D Fluorescence Imaging
Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract]  Rat tail collagen solutions have been used as polymerizable in vitro three-dimensional (3D) extracellular matrix (ECM) gels for single and collective cell migration assays as well as spheroid formation. These 3D hydrogels are a relatively inexpensive, simple to use model system that can mimic the in vivo physical characteristics of numerous tissues within the body, namely the skin. While confocal imaging techniques such as fluorescence reflection and two-photon microscopy are able to visualize collagen fibrils during 3D imaging without fluorescence, other imaging modalities require direct conjugation of fluorescent dyes to collagen. Here we detail how to generate 3D collagen gels labeled with a fluorescent dye. Furthermore, we go through the steps required to ... [摘要]  大鼠尾胶原溶液已被用作可聚合的体外三维(3D)细胞外基质(ECM)凝胶,用于单一和集体细胞迁移测定以及球状体形成。 这些3D水凝胶是相对便宜,易于使用的模型系统,其可以模拟体内许多组织(即皮肤)的体内物理特征。 虽然诸如荧光反射和双光子显微镜的共焦成像技术能够在没有荧光的3D成像期间可视化胶原原纤维,但是其他成像模式需要荧光染料直接缀合到胶原。 在这里,我们详细介绍了如何生成用荧光染料标记的3D胶原凝胶。 此外,我们还经历了可重复生成适用于活细胞3D成像技术的明亮胶原水凝胶所需的步骤。

【背景】自20世纪50年代以来,Paul Weiss和Beatrice Garber最初观察到增加血浆浓度(纤维蛋白)对间充质细胞形态的影响(Weiss和Garber,1952),开始研究细胞迁移和细胞与周围微环境的相互作用。在随后的几十年中,生物化学家开始深入研究从鼠尾胶原中纯化提取物,并开始将其用作高度可聚合的3D基质(Fitch et al。,1955; Gross et al。,1955; Chandrakasan et al。,1976)。直到20世纪90年代,3D矩阵才真正对细胞生物学界有用,尤其是研究细胞迁移(Friedl et ...

Fluorescent Measurement of Synaptic Activity Using FM Dyes in Dissociated Hippocampal Cultured Neurons
Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract]  Release and recycling of synaptic vesicles are essential for neurotransmission and synaptic plasticity. To gain mechanistic understanding of these processes, direct measurements of vesicle release and retrieval is indispensable. Styryl dyes like FM1-43 and FM4-64 have been widely used for this purpose and their loading and unloading are reliable measurements for synaptic vesicle release and retrieval in cultured neurons. This protocol describes in detail the procedure of using styryl dyes to label and measure synaptic vesicle uptake and release in cultured rat hippocampal neurons. We also include a brief description of hippocampal culture. In the end, we briefly discuss the commonality and difference among FM dye, pH-sensitive fluorescent proteins and quantum dots in terms of measuring ... [摘要]  突触小泡的释放和再循环对于神经传递和突触可塑性是至关重要的。 为了获得对这些过程的机械理解,直接测量囊泡释放和回收是必不可少的。 苯乙烯基染料如FM1-43和FM4-64已被广泛用于此目的,其装载和卸载是可靠的测量突触小泡释放和恢复培养的神经元。 该协议详细描述了使用苯乙烯基染料来标记和测量培养的大鼠海马神经元中的突触小泡摄取和释放的程序。 我们还包括对海马文化的简要描述。 最后,我们简要讨论FM染料,pH敏感荧光蛋白和量子点在测量突触小泡行为方面的共性和差异。
【背景】突触小泡是神经传递不可或缺的,因为它们是化学突触中负责神经递质释放的唯一细胞器。它们的数量,释放概率,融合动力学和再循环路线定义了突触传递和神经元交流。已经开发了多种用于探测突触囊泡的工具,包括突触后神经元的电生理学记录,膜运输的电容测量,可氧化的发射体的电流分析,固定突触的电子显微镜成像以及活神经元中的囊泡标记的荧光成像。在所有现有的方法中,最后一个是不仅产生关于个体突触的空间和时间信息,而且提供高吞吐量(即,来自不同神经元的单个突触的更多数据点)的唯一方法。已经开发了基于不同定向和报告机制的各种荧光探针。二十多年前发明的苯乙烯基染料(即FM染料,包括FM1-43,FM4-64,FM5-95)仍然是一种可靠而方便的工具。由于其对脂质膜的中等亲和力及其对脂质敏感的排放,可以容易地装载到再循环的突触囊泡中并且当这些囊泡被胞吐出时释放。使用更敏感的光电探测器如EMCCD,FM染料可以报告单个囊泡释放事件。在这里,我们提供了一个相对完整的基于FM的啮齿动物海马神经元原代培养的突触小泡释放成像的描述。此外,我们还讨论了FM染料和其他荧光泡标签的共性和区别。 ...

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