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HEPES

HEPES

Company: Sigma-Aldrich
Catalog#: H4034
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Fluorescent Measurement of Synaptic Activity Using FM Dyes in Dissociated Hippocampal Cultured Neurons
Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract]  Release and recycling of synaptic vesicles are essential for neurotransmission and synaptic plasticity. To gain mechanistic understanding of these processes, direct measurements of vesicle release and retrieval is indispensable. Styryl dyes like FM1-43 and FM4-64 have been widely used for this purpose and their loading and unloading are reliable measurements for synaptic vesicle release and retrieval in cultured neurons. This protocol describes in detail the procedure of using styryl dyes to label and measure synaptic vesicle uptake and release in cultured rat hippocampal neurons. We also include a brief description of hippocampal culture. In the end, we briefly discuss the commonality and difference among FM dye, pH-sensitive fluorescent proteins and quantum dots in terms of measuring ... [摘要]  突触小泡的释放和再循环对于神经传递和突触可塑性是至关重要的。 为了获得对这些过程的机械理解,直接测量囊泡释放和回收是必不可少的。 苯乙烯基染料如FM1-43和FM4-64已被广泛用于此目的,其装载和卸载是可靠的测量突触小泡释放和恢复培养的神经元。 该协议详细描述了使用苯乙烯基染料来标记和测量培养的大鼠海马神经元中的突触小泡摄取和释放的程序。 我们还包括对海马文化的简要描述。 最后,我们简要讨论FM染料,pH敏感荧光蛋白和量子点在测量突触小泡行为方面的共性和差异。
【背景】突触小泡是神经传递不可或缺的,因为它们是化学突触中负责神经递质释放的唯一细胞器。它们的数量,释放概率,融合动力学和再循环路线定义了突触传递和神经元交流。已经开发了多种用于探测突触囊泡的工具,包括突触后神经元的电生理学记录,膜运输的电容测量,可氧化的发射体的电流分析,固定突触的电子显微镜成像以及活神经元中的囊泡标记的荧光成像。在所有现有的方法中,最后一个是不仅产生关于个体突触的空间和时间信息,而且提供高吞吐量(即,来自不同神经元的单个突触的更多数据点)的唯一方法。已经开发了基于不同定向和报告机制的各种荧光探针。二十多年前发明的苯乙烯基染料(即FM染料,包括FM1-43,FM4-64,FM5-95)仍然是一种可靠而方便的工具。由于其对脂质膜的中等亲和力及其对脂质敏感的排放,可以容易地装载到再循环的突触囊泡中并且当这些囊泡被胞吐出时释放。使用更敏感的光电探测器如EMCCD,FM染料可以报告单个囊泡释放事件。在这里,我们提供了一个相对完整的基于FM的啮齿动物海马神经元原代培养的突触小泡释放成像的描述。此外,我们还讨论了FM染料和其他荧光泡标签的共性和区别。 ...

Mutant Huntingtin Secretion in Neuro2A Cells and Rat Primary Cortical Neurons
Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract]  Quantitative analysis of proteins secreted from the cells poses a challenge due to their low abundance and the interfering presence of a large amount of bovine serum albumin (BSA) in the cell culture media. We established assays for detection of mutant huntingtin (mHtt) secreted from Neuro2A cell line stably expressing mHtt and rat primary cortical neurons by Western blotting. Our protocol is based on reducing the amounts of BSA in the media while maintaining cell viability and secretory potential, and concentrating the media prior to analysis by means of ultrafiltration. [摘要]  由细胞分泌的蛋白质的定量分析由于它们的丰度低和在细胞培养基中干扰大量牛血清白蛋白(BSA)的存在而提出挑战。 我们建立检测突变亨廷顿蛋白(mHtt)检测分泌Neuro2A细胞系稳定表达mHtt和大鼠原代皮层神经元蛋白质印迹。 我们的方案是基于降低培养基中BSA的量,同时保持细胞活力和分泌潜能,并在通过超滤分析之前浓缩培养基。


【背景】许多蛋白质通过各种分泌途径从细胞分泌到细胞外环境中。这些途径包括在ER-高尔基体 - 质膜途径之后的常规分泌途径(Lee等,2004)和多个非常规途径,例如溶酶体胞吐作用,穿过质膜的易位和外泌体以及胞外体释放(Zhang和Schekman,2013)。为了研究这些途径,经常需要分析培养细胞分泌的蛋白质进入培养基。蛋白质可以游离形式分泌,也可以与胞膜结构如胞外体和外泌体结合(Zhang and ...

Live Imaging of Axonal Transport in the Motor Neurons of Drosophila Larvae
Author:
Date:
2017-12-05
[Abstract]  Axonal transport, which is composed of microtubules, motor proteins and a variety of types of cargo, is a prominent feature of neurons. Monitoring these molecular dynamics is important to understand the biological processes of neurons as well as neurodegenerative disorders that are associated with axonal dysfunction. Here, we describe a protocol for monitoring the axonal transport of motor neurons in Drosophila larvae using inverted fluorescence microscopy. [摘要]  由微管,运动蛋白和各种类型的货物组成的轴突运输是神经元的突出特征。 监测这些分子动力学对于了解神经元的生物过程以及与轴突功能障碍相关的神经退行性疾病是重要的。 在这里,我们描述了使用倒置荧光显微镜监测果蝇幼虫中运动神经元的轴突运输的协议。

【背景】轴突是一种独特的神经元结构,神经元通过该结构将电信号和化学信号传递给邻近的神经元,肌肉和其他组织。通过囊泡,细胞器和材料的循环流动或穿梭来维持轴突功能(Liu等人,2012; Wong等人,2012; Alami等人,2014)。轴突功能障碍被认为是神经退行性病变的早期征兆,并且是人类中阿尔茨海默病,帕金森病和运动神经元疾病等神经退行性疾病的原因(Hirokawa等人,2010; Millecamps and Julien,2013)。然而,在人类和哺乳动物模型中难以监测这些神经退行性疾病中的轴突变性过程。果蝇模型是研究分子遗传水平的神经退行性疾病的有力工具,并通过体内神经元的实时成像为治疗方法提供了重要的证据(Shiba-福岛等人,2014; Hosaka等人,2017)。直立荧光显微镜技术通常用于分析组织和器官培养物的活体成像。然而,由于其广泛的实用性和可扩展性,倒置荧光显微镜已经看到需求增加。在这里,我们介绍我们的协议来分析使用倒置荧光显微镜的果蝇的第三龄幼虫的运动神经元的轴突运输。

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