| Ex vivo Whole-cell Recordings in Adult Drosophila Brain
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Author:
Date:
2018-07-20
[Abstract] Cost-effective and efficient, the fruit fly (Drosophila melanogaster) has been used to make many key discoveries in the field of neuroscience and to model a number of neurological disorders. Great strides in understanding have been made using sophisticated molecular genetic tools and behavioral assays. Functional analysis of neural activity was initially limited to the neuromuscular junction (NMJ) and in the central nervous system (CNS) of embryos and larvae. Elucidating the cellular mechanisms underlying neurological processes and disorders in the mature nervous system have been more challenging due to difficulty in recording from neurons in adult brains. To this aim we developed an ex vivo preparation in which a whole brain is isolated from the head capsule of an adult ...
[摘要] 果蝇（ Drosophila melanogaster ）具有成本效益和效率，已被用于在神经科学领域进行许多重要发现并模拟许多神经疾病。使用复杂的分子遗传工具和行为测定已经在理解方面取得了很大进展。神经活动的功能分析最初仅限于神经肌肉接头（NMJ）和胚胎和幼虫的中枢神经系统（CNS）。阐明成熟神经系统中神经过程和病症潜在的细胞机制由于难以从成人大脑中的神经元记录而更具挑战性。为此目的，我们开发了一种离体制剂，其中从成年蝇的头部胶囊中分离出全脑并将其置于记录室中。通过这种制备，可以将成年大脑中鉴定的神经元的全细胞记录与遗传，药理学和环境操作相结合，以探索神经元功能和功能障碍的细胞机制。它还作为评估通过用于治疗神经疾病的行为测定法鉴定的新疗法的作用机制的重要平台。在这里，我们提出了成人 Drosophila 脑中离体制剂和全细胞记录的方案。
【背景】果蝇（ Drosophila melanogaster ）已被用于在神经科学的各个基本领域（包括学习和记忆）中取得重要发现（Bolduc et al。，2008; Cervantes- Sandoval et al。，2016），突触形成和调节（Genç et al。，2017）和昼夜节律（Allada et al。 ，1998; Guo et ...
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| Advanced Design of Minimalistic Dumbbell-shaped Gene Expression Vectors
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] Minimal DNA vectors exclusively comprising therapeutically relevant sequences hold great promise for the development of novel therapeutic regimen. Dumbbell-shaped vectors represent non-viral non-integrating DNA minimal vectors which have entered an advanced stage of clinical development (Hardee et al., 2017). Spliceable introns and DNA nuclear import signals such as SV40 enhancer sequences are molecular features that have found multiple applications in plasmid vectors to improve transgene expression. In dumbbells however, effects triggered by introns were not investigated and DNA-based nuclear import sequences have not found applications yet, presumably because dumbbell vectors have continuously been minimized with regard to size. We investigated the effects of an intron and/or ...
[摘要] 唯一包含治疗相关序列的最小DNA载体对于新型治疗方案的发展具有很大的希望。哑铃型载体代表已经进入临床发展的晚期阶段的非病毒非整合DNA最小载体（Hardee等人，2017）。可接合的内含子和DNA核输入信号如SV40增强子序列是在质粒载体中发现多个应用以改善转基因表达的分子特征。然而，在哑铃中，由内含子引发的效应未被研究，基于DNA的核导入序列尚未发现应用，可能是因为哑铃载体在尺寸上不断被最小化。我们调查内含子和/或SV40增强子衍生序列对哑铃载体驱动的报告基因表达的影响。发现可拼接内含子的实现在所有研究的细胞系中无条件地增强基因表达。相反，SV40增强子的使用改善了细胞类型依赖性的基因表达。虽然这两个特征显着增加哑铃载体大小，但内含子和增强子或两者的组合都不会对基因表达产生负面影响。相反，与质粒或对照哑铃相比，这两个特征在一起改善了哑铃驱动的基因表达，高达160-或56倍。因此，强烈建议考虑用于哑铃矢量设计的内含子和SV40增强子。这种先进的设计可以促进哑铃型DNA载体的临床前和临床应用。
【背景】虽然许多基因已经使用哑铃形DNA载体表达，但大多数这些应用使用包括启动子，编码序列（CDS）和转录终止子的基本设计。一些载体包括嵌合内含子，然而，没有报道通过这种设计增强了转基因表达（Schirmbeck等人，2001）。在这里，我们研究了分子特征引发的效应，这些特征经常在哑铃驱动基因表达的质粒设计中得到应用：1.已知来自人β-珠蛋白基因剪接的嵌合内含子促进RNA加工，核出口，随后基因表达（Luo ...
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| Non-radioactive LATS in vitro Kinase Assay
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Author:
Date:
2017-07-20
[Abstract] This protocol describes a method to directly measure LATS activity by an in vitro kinase assay using YAP as a substrate.
[摘要] 该方案描述了通过使用YAP作为底物的体外激酶测定直接测量LATS活性的方法。
【背景】大肿瘤抑制剂1/2（LATS1 / 2）是河马途径的蛋白激酶和核心成分，其调节器官大小和组织稳态。 LATS激酶通过其疏水基序上的磷酸化被激活（HM，对于LATS1为Thr 1079，对于LATS2为Thr 1041）。 结果，在HM中识别LATS的抗体抗体的Western印迹提供了评估LATS激酶活性的间接方法（Data analysis，图1）。 此外，活性LATS在Ser 127磷酸化并抑制转录共激活物是相关蛋白（YAP），导致YAP结合到14-3-3和细胞质保留（Zhao等人，2007）。 在LATS体外激酶测定中使用YAP作为底物提供了直接评估LATS激酶活性的方法。 通过该测定，我们能够显示血清饥饿和山梨醇诱导的渗透激活LATS（Yu等人，2012; Hong等人，2017）和进一步的 导致YAP Ser 127磷酸化（数据分析，图2）。
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