| Lipid Droplet Isolation from Arabidopsis thaliana Leaves
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Author:
Date:
2020-12-20
[Abstract] Lipid droplets (LDs) are neutral lipid aggregates surrounded by a phospholipid monolayer and specific proteins. In plants, they play a key role as energy source after seed germination, but are also formed in vegetative tissues in response to developmental or environmental conditions, where their functions are poorly understood. To elucidate these, it is essential to isolate LDs with good yields, while retaining their protein components. LD isolation protocols are based on their capacity to float after centrifugation in sucrose gradients. Early strategies using stringent conditions and LD-abundant plant tissues produced pure LDs where core proteins were identified. To identify more weakly bound LD proteins, recent protocols have used low stringency buffers, but carryover contaminants and ...
[摘要] [摘要]脂质滴（LDs）是被磷脂单层和特定蛋白质包围的中性脂质聚集体。在植物中，它们在种子发芽后作为能源起着关键作用，但由于发育或环境条件而对其功能了解甚少，它们也在营养组织中形成。为了阐明这些，必须分离出具有高产率的LD，同时保留其蛋白质成分。LD分离方案基于其在蔗糖梯度中离心后的漂浮能力。早期使用严格条件和LD丰富的植物组织的策略产生了可鉴定核心蛋白的纯LD。为了鉴定更弱结合的LD蛋白，最近的研究otocols使用了低严格性的缓冲液，但是残留污染物和低收率通常是个问题。我们已经开发了一种基于蔗糖梯度的方案，可使用Tween-20和新鲜组织从拟南芥叶中分离LD，以提高产量。在健康和细菌感染的拟南芥叶片中，该方案均允许鉴定LD蛋白，随后通过显微镜分析对其进行确认。
背景]脂质降住所（LD）的通过由磷脂单层，其中LD蛋白插入包围的中性脂质核心组成的细胞器（Tzen等人，1993） 。LD首先被描述为稳定的隔室，用于在特殊组织中存储高能脂质。然而，最近的评论将LDs描述为大多数细胞类型中存在的高度动态的细胞器，其功能超越了单纯的能量存储（Shimada等人，2018; Huang，2018; Shao等人，2019）。
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| Determining Ribosome Translational Status by Ribo-ELISA
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] The Ribo-ELISA was originally developed to elucidate the basis for the ribopuromycylation method (RPM)-based detection of ribosome bound nascent chains. The Ribo-ELISA enables characterization of the translational status of ribosomes, and can be applied to the discovery of super-ribosomal complexes with novel ribosome associated macromolecules that are isolated by physical fractionation in sucrose gradients or other methods.
[摘要] Ribo-ELISA最初是为阐明基于核糖核苷酸化方法（RPM）的核糖体结合新生链检测的基础而开发的。 Ribo-ELISA能够表征核糖体的翻译状态，并且可以应用于通过蔗糖梯度中的物理分离或其他方法分离的新型核糖体相关大分子的超核糖体复合物的发现。
【背景】核糖体是由40S和60S亚单位组成的异构结构，当多个核糖体与单个mRNA结合时，它们以单体和多核糖体存在于细胞中。 另外，翻译核糖体可以与调节翻译的多个分子复合物相关联。 核糖体ELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）能够通过核糖体相关新生链的体外嘌呤化检测翻译核糖体（David等人，2012）。 在将嘌呤霉素添加至具有结合的新生链的核糖体时，这种化学反应自发进行。 该方法定量测定每个核糖体中出现的新生链的数量，并且可以用于确定单核细胞相对于多核糖体的翻译状态，并鉴定结合其他大分子的核糖体，其改变其在沉淀柱中的沉降速率或迁移。
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| Isolation of Ribosomal Particles from the Unicellular Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803
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Date:
2017-03-20
[Abstract] Isolation of ribosomal particles is an essential step in the study of ribosomal components as well as in the analysis of trans-acting factors that interact with the ribosome to regulate protein synthesis and modulate the expression profile of the cell in response to different environmental conditions. In this protocol, we describe a procedure for the isolation of 70S ribosomes from the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 (hereafter Synechocystis). We have successfully used this protocol in our study of the cyanobacterial ribosomal-associated protein LrtA, which is a homologue of bacterial HPF (hibernation promoting factor) (Galmozzi et al., 2016).
[摘要] 核糖体颗粒的分离是研究核糖体组分以及与核糖体相互作用以调节蛋白质合成并调节细胞表达谱的反式因子的分析中必不可少的步骤响应不同的环境条件。在本协议中，我们描述了从单细胞蓝细菌集胞藻分离70S核糖体的过程。 PCC 6803（以下简称集胞藻）。我们已经成功地使用这个方案来研究蓝细菌核糖体相关蛋白LrtA，它是细菌HPF（冬眠促进因子）的同系物（Galmozzi等人，2016）。
背景 据报道蓝藻核糖体几乎没有生物化学研究。已经通过差速离心分离70S核糖体颗粒，然后通过二维电泳分析核糖体蛋白质（Sato et al。，et al。 ，1998）。核糖体也已经从聚球藻（Spechococcus）进行制备。 PCC 6301细胞使用组合差速离心和蔗糖步骤梯度的方案（Sugita等人，2000）。通过差速离心分离细胞提取物也被用于制备核糖体样品用于在不同的聚球藻菌株中开发体外翻译系统（Mutsuda和Sugiura，2006 ）。基于针对聚球藻（Sugita等人，2000）所述的方法，本文所述的针对集胞藻的方法允许使用以下方式纯化核糖体颗粒线性蔗糖梯度的超速离心。
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