| Protocol for Establishing a Multiplex Image-based Autophagy RNAi Screen in Cell Cultures
|
|
Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] Autophagy is a recycling pathway, in which intracellular cargoes including protein aggregates and bacteria are engulfed by autophagosomes and subsequently degraded after fusion with lysosomes. Dysregulation of this process is involved in several human diseases such as cancer or neurodegeneration. Hence, advancing our understanding of how autophagy is regulated provides an opportunity to explore druggable targets and subsequently develop treatment strategies for these diseases. To identify novel autophagy regulators, we developed an image-based phenotypic RNAi screening approach using autophagic marker proteins at endogenous levels (Jung et al., 2017). In contrast to previously performed autophagy screens, this approach does not use overexpressed, tagged autophagy marker proteins ...
[摘要] 自噬是一种循环途径，其中细胞内货物包括蛋白质聚集体和细菌被自噬吞噬，随后与溶酶体融合后降解。这种过程的失调涉及几种人类疾病，如癌症或神经退行性疾病。因此，提高我们对自噬如何监管的理解提供了探索可药用靶标的机会，并随后制定了这些疾病的治疗策略。为了鉴定新的自噬调节因子，我们开发了一种基于图像的表型RNAi筛选方法，在内源水平上使用自噬标记蛋白（Jung et al。，2017）。与以前进行的自噬屏幕相比，该方法不使用过表达标记的自噬标记蛋白，而是在内源水平检测自噬结构。此外，我们同时监测自噬的早期和晚期阶段，而其他筛选仅使用单个自噬体标志物大多为GFP-LC3B。在这里，我们详细描述了这种多重筛选方案，并讨论了如何建立基于图像的siRNA筛选的一般考虑。
【背景】自噬是一种细胞内质量和数量控制途径，通过这种途径，多种细胞溶质材料如病原体，细胞器或其部分，蛋白质和其他大分子被双重膜结构所吞噬，造成自噬体，并在自噬体与溶酶体融合后进行大量溶酶体降解。自体吞噬体的形成及其对自体溶酶体的成熟是一个高度规范的过程。在酵母中最初鉴定的AuTophaGy相关（ATG）基因是泛蛋白样蛋白Atg8，其通过与位于受体自噬体中的磷脂磷脂酰乙醇胺（PE）的可逆缀合以高度局部化的方式发挥其功能。人类细胞含有六个ATG8家族成员，可以分为两个亚科：i）微管相关蛋白1A / ...
|
|
|
| Isolation and Analysis of Stromal Cell Populations from Mouse Lymph Nodes
|
|
Author:
Date:
2017-08-20
[Abstract] Our protocol describes a simple procedure for isolating stromal cells from lymph nodes (LN). LN are disrupted then enzymatically digested with collagenase and dispase to produce a single cell suspension that can be stained with fluorescently labelled antibodies and analysed by flow cytometry. This protocol will enable identification of fibroblastic reticular cells (FRC), lymphatic endothelial cells (LEC), blood endothelial cells (BEC) as PNAd+ BEC that form LN high endothelial venules (HEV). This method can be applied to examine LN stromal cell responses during inflammatory events induced by infections or immunologic adjuvants and to subset most leukocytes found in LN.
[摘要] 我们的方案描述了从淋巴结（LN）分离基质细胞的简单过程。 LN被破坏，然后用胶原酶和分散酶酶消化以产生可以用荧光标记的抗体染色的单细胞悬浮液并通过流式细胞术分析。 该方案能够识别形成LN高内皮小静脉（HEV）的PNAd + BEC的成纤维细胞网状细胞（FRC），淋巴内皮细胞（LEC），血液内皮细胞（BEC）。 该方法可以用于检测由感染或免疫佐剂诱导的炎症事件期间的LN基质细胞反应，并且在LN中发现大多数白细胞。
【背景】淋巴结（LN）由间充质和内皮基质细胞的复杂网络构成。这些包括成纤维细胞网状细胞（FRCs），淋巴内皮细胞（LECs）和血液内皮细胞（BECs）。这些基质细胞组织了LN的复杂微结构，使得能够支持免疫细胞迁移，体内平衡，耐受性和细胞相互作用，以引发对病原体和肿瘤的免疫应答。我们已经表明，LN基质细胞可以响应于炎症信号而增殖和扩张，并且将免疫细胞募集到伴随感染的LN中（Gregory等，2017）。这些基质细胞也可以显着调节其转录程序以应对感染，从而支持持续的免疫应答。该方案使稳定状态和疾病期间LN的基质细胞亚群可靠地分离。这使得LN基质细胞的表型，功能，遗传或表观遗传学研究揭示了它们如何有助于组织体内平衡和免疫应答。
|
|
|
| Improved Oviduct Transfer Surgery for Genetically Modified Rat Production
|
|
Author:
Date:
2017-08-20
[Abstract] Rat embryo transfer surgeries are becoming more common with targeted nucleases increasing the demand for rat models. This protocol details pre-surgical preparation, improved surgical techniques for placing embryos into the oviduct, and post-surgical care of rats to parturition. Direct application of mouse oviduct transfer protocols results in limited success in the rat. By combining techniques from several widely used protocols in the field, increased yield of live pups born to healthy dams is possible. This protocol is distinct from previously published protocols by the use of a modified anesthesia protocol (Smith et al., 2004), use of analgesia, the addition of peritoneal sutures (Filipiak and Saunders, 2006), incision location and number of transfers per animal (Krinke et al. ...
[摘要] 大鼠胚胎移植手术正变得越来越普遍，靶向核酸酶增加对大鼠模型的需求。 该协议详细介绍了手术前准备，将胚胎置入输卵管的改进的外科技术以及大鼠分娩后的手术后护理。 直接应用小鼠输卵管转移方案在大鼠中的成功有限。 通过组合来自现场广泛使用的几种方案的技术，可以提高健康水坝出生的活的小狗的产量。 该方案与以前公开的方案不同，通过使用改进的麻醉方案（Smith等人，2004），使用止痛剂，添加腹膜缝线（Filipiak和Saunders，2006），切割位置和每只动物的转移数 （Krinke等，2000）。
【背景】在显微注射和胚胎移植手术后可靠地生产健康小狗的能力对于模型创建至关重要，特别是创建多个创始动物的可能性增加，对观察到的表型有信心。因此，即使使用不同浓度的注射液，出生率相对于报告的比例较低，系统地对现有的小鼠胚胎移植方案进行了修改，以更好地适应大鼠。
多个出版物描述了将胚胎转移到两侧子宫的两个角的输卵管;然而，这增加了动物在麻醉下的时间长度，并且需要中线切口并穿过腹膜腔以到达侧生殖道，或者产生两个单独的切口（Krinke等人，2000）。这些选择不太理想，因为这两个选项都会增加动物的压力，从而增加妊娠中止的可能性。通过在术前和术后创建单侧切口并施用镇痛，动物的压力被最小化（Smith等人，2004）。使用异氟烷可注射麻醉剂可以最大程度地降低毒性风险（如三溴乙醇所见），IP注射损伤和重复给药，所有这些都与啮齿动物手术后的死亡率相关（Bernal ...
|
|
|