| Determination of Intracellular Ca2+ Concentration in the Human Pathogens Trypanosomatids Leishmania mexicana and Trypanosoma cruzi by the Use of the Fluorescent Ca2+ Indicator Fura-2
|
|
Author:
Date:
2020-09-20
[Abstract] Ca2+ is an essential signaling messenger in all eukariotic cells, playing a pivotal role in many cellular functions as cell growth control (differentiation, fertilization and apoptosis), secretion, gene expression, enzyme regulation, among many others. This basic premise includes trypanosomatids as Trypanosoma cruzi and various species of Leishmania, the causative agents of Chagas disease and leishmaniasis respectively, where intracellular Ca2+ concentration ([Ca2+]i) has been demonstrated to be finely regulated. Nevertheless [Ca2+]i has been difficult to measure because of its very low cytoplasmic concentration (typically around 50-100 nM), when compared to the large concentration in the outside milieu ...
[摘要] [摘要] Ca 2+ 是所有真核细胞中必不可少的信号信使，在许多细胞功能中起着关键作用，例如细胞生长控制（分化，受精和凋亡），分泌，基因表达，酶调控等。这个基本前提包括锥虫如锥虫克氏锥虫和各种物种利什曼原虫，分别南美锥虫病和利什曼病的病原体，其中细胞内Ca 2+ 浓度（[钙2 + ] 我）已被证明被精细地调节。然而，[Ca 2 + ] i 与外界环境中的高浓度（血液中约2 mM）相比，由于其细胞质浓度非常低（通常约为50-100 nM ）而难以测量。细胞内荧光Ca 2+ 敏感指示剂的开发对于实现该目标至关重要。成功的基础是乙酰氧甲基化衍生物前体的合成，该合成物使通常由许多亲水性羧基组成的荧光分子（其非常亲和的Ca 2+ 结合（因此非常亲水））容易穿过质膜。一旦进入细胞内部，非特异性酯酶会将疏水部分从荧光骨架结构中分离出来，释放出羧基，然后将其转化为分子的酸形式，该分子保留在细胞质中并恢复其在Ca中发荧光的能力。2+ 依赖方式。其中，的Fura-2是迄今为止最常用的，因为它是一个比例（两个不同的波长激发和一个发射）的Ca 2+ 与钙指示剂2+ 与内[Ca亲和力兼容2 + ] 我。该协议主要包括用Fura-2加载指数相寄生虫，并通过双波长荧光分光光度计记录[Ca 2 + ] i 中的变化。这种技术允许有价值的信息AB的获取出的[Ca 2 + ] 我Ç ...
|
|
|
| Optogenetic Tuning of Ligand Binding to The Human T cell Receptor Using The opto-ligand-TCR System
|
|
Author:
Date:
2020-03-05
[Abstract] T cells are one major cell type of the immune system that use their T cell antigen receptor (TCR) to bind and respond to foreign molecules derived from pathogens. The ligand-TCR interaction half-lives determine stimulation outcome. Until recently, scientists relied on mutating either the TCR or its ligands to investigate how varying TCR-ligand interaction durations impacted on T cell activation. Our newly created opto-ligand-TCR system allowed us to precisely and reversibly control ligand binding to the TCR by light illumination. This system uses phytochrome B (PhyB) tetramers as a light-regulated TCR ligand. PhyB can be photoconverted between a binding (ON) and non-binding (OFF) conformation by 660 nm and 740 nm light illumination, respectively. PhyB ON is able to bind to a synthetic ...
[摘要] [摘要] T细胞是免疫系统的一种主要细胞类型，利用其T细胞抗原受体（TCR）结合并响应源自病原体的外来分子。配体-TCR相互作用的半衰期决定了刺激的结果。直到最近，科学家还是依靠突变TCR或其配体来研究变化的TCR-配体相互作用持续时间如何影响T细胞活化。我们新创建的光配体-TCR系统使我们能够通过光照精确且可逆地控制配体与TCR的结合。该系统使用植物色素B（PhyB ）四聚体作为光调节的TCR配体。PHYB 可光转化的结合（ON）之间，并且通过分别为660nm和740nm的光照射，非结合性（OFF）构象。PhyB ON能够结合通过将PhyB 相互作用因子（PIF）融合到TCRβ链而产生的合成TCR 。将PhyB 切换为OFF构象会破坏这种相互作用。PhyB 四聚体与PIF-TCR 足够长的结合导致T细胞活化（通过钙内流测量）。在这里，我们描述了有关如何为我们的光配体-TCR系统生成四聚体配体，如何通过流式细胞仪测量配体-TCR结合以及如何通过钙内流量化T细胞活化的协议。
[背景 ] ...
|
|
|
| Measurement of the Intracellular Calcium Concentration with Fura-2 AM Using a Fluorescence Plate Reader
|
|
Author:
Date:
2017-07-20
[Abstract] Intracellular calcium elevation triggers a wide range of cellular responses. Calcium responses can be affected or modulated by membrane receptors mutations, localization, exposure to agonists/antagonists, among others (Burgos et al., 2007; Martínez et al., 2016). Changes in intracellular calcium concentration can be measured using the calcium sensitive fluorescent ratiometric dye fura-2 AM. This method is a high throughput way to measure agonist mediated calcium responses.
[摘要] 细胞内钙升高引发广泛的细胞反应。 钙响应可能受到膜受体突变，定位，暴露于激动剂/拮抗剂等的影响或调节（Burgos et al。，2007;Martínez等人，2016年））。 细胞内钙浓度的变化可以使用钙敏感荧光比例染料fura-2 AM测量。 该方法是测量激动剂介导的钙反应的高通量方法。
【背景】G蛋白偶联受体的激活触发了数百或数千个第二信使分子的产生。一旦被刺激，G蛋白偶联受体激活磷脂酶C（PLC），其将磷脂酰肌醇4,5-二磷酸酯（PIP 2 N）切割成二酰基甘油（DAG）和肌醇1 ，4,5-三磷酸酯（IP 3+）。 DAG保持膜结合，并且IP 3被释放到胞质溶胶中，其结合到内质网（ER）中的特异性IP 3'受体（钙通道）。这导致调节钙结合蛋白和蛋白激酶C（PKC）的激活的细胞内钙浓度的增加。因此，考虑到钙在生物系统中的重要性，已经建立了许多分析和测量Ca 2+水平的技术/方法。
＆NBSP;为确定细胞内Ca 2+浓度，荧光指示剂特别有用。 Ca 2 + 指示符可用于亲和力，亮度或光谱特性的变化。 Fura-2-乙酰氧基甲酯（fura-2 AM）是比例计算的钙指示剂fura-2的膜可渗透的非侵入性衍生物。 Fura-2 AM穿过细胞膜，一旦在细胞内，细胞酯酶除去乙酰氧基甲基。 Ca 2 + -bound fura-2 AM在335 ...
|
|
|