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Trizma® base

(NH 4)2 SO4

Company: Sigma-Aldrich
Catalog#: T6066
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Company-protocol()
Other protocol()

Guanine Nucleotide Exchange Assay Using Fluorescent MANT-GDP
Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract]  GTPases are molecular switches that cycle between the inactive GDP-bound state and the active GTP-bound state. GTPases exchange nucleotides either by its intrinsic nucleotide exchange or by interaction with guanine nucleotide exchange factors (GEFs). Monitoring the nucleotide exchange in vitro, together with reconstitution of direct interactions with regulatory proteins, provides key insights into how a GTPase is activated. In this protocol, we describe core methods to monitor nucleotide exchange using fluorescent N-Methylanthraniloyl (MANT)-guanine nucleotide. [摘要]  GTP酶是分子开关,在无效GDP结合状态和活性GTP结合状态之间循环。 GTP酶通过其内在的核苷酸交换或通过与鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)的相互作用来交换核苷酸。 监测体外核苷酸交换,以及与调节蛋白直接相互作用的重构,为GTP酶如何被激活提供了重要见解。 在该协议中,我们描述了使用荧光N-甲基呋喃酰基(MANT) - 鸟嘌呤核苷酸来监测核苷酸交换的核心方法。

【背景】GTPase是鸟嘌呤核苷酸结合蛋白,调节细胞过程的广度,从蛋白质生物合成到细胞周期进展,从细胞骨架重组到膜运输。 GTPases可以被认为是分子开关,它在GDP结合“关闭”状态和GTP结合“开启”状态之间循环;在通过GTP的GDP核苷酸交换结合GTP时,GTP酶变得活跃并且将结合下游效应蛋白以招募和激活这些效应子的生物学功能。 GTP酶通过与开关I环(G2结构域)的高度保守苏氨酸和开关II环(G3结构域)的DxxG基序内的甘氨酸的相互作用结合GTP的γ-磷酸。 GTP水解后,与γ-磷酸相互作用的丧失导致动态构象变化,从而使GTPase变为关闭状态(Vetter and ...

Conditional Knockdown of Proteins Using Auxin-inducible Degron (AID) Fusions in Toxoplasma gondii
Author:
Date:
2018-02-20
[Abstract]  Toxoplasma gondii is a member of the deadly phylum of protozoan parasites called Apicomplexa. As a model apicomplexan, there is a great wealth of information regarding T. gondii’s 8,000+ protein coding genes including sequence variation, expression, and relative contribution to parasite fitness. However, new tools are needed to functionally investigate hundreds of putative essential protein coding genes. Accordingly, we recently implemented the auxin-inducible degron (AID) system for studying essential proteins in T. gondii. Here we provide a step-by-step protocol for examining protein function in T. gondii using the AID system in a tissue culture setting. [摘要]  弓形虫是原生动物寄生虫称为Apicomplexa致命门的一员。 作为一个复杂的模型,关于T的信息有很多。 gondii的8,000多种蛋白质编码基因,包括序列变异,表达和对寄生虫适应的相对贡献。 然而,需要新的工具来功能性地调查数百个推定的必需蛋白质编码基因。 因此,我们最近实施了生长素诱导降解(AID)系统来研究T中的基本蛋白质。弓形虫。 在这里,我们提供了一个检查蛋白质功能的一步一步的协议。 在组织培养环境中使用AID系统。

【背景】生长素是一类通过靶向某些蛋白质在植物中进行蛋白酶体降解而发出信号的植物激素(Teale等人,2006)。 Kohei Nishimura等人具有将该植物特异性信号传导系统的组分转移到其他真核生物中用于有兴趣的蛋白质(POI)的条件调节,创建生长素诱导降解(AID)系统的聪明想法(Nishimura等人,2009)。这个系统已经被成功地用于几种真核生物,包括疟原虫疟原虫(Kreidenweiss et al。,2013; Philip和Waters,2015)。只需要两个转基因成分来实现这个系统,称为转运抑制剂反应1(TIR1)的植物生长素受体和用AID标记的POI。用生长素(例如,3-吲哚乙酸/ IAA)处理活化SCF ...

Registration and Alignment Between in vivo Functional and Cytoarchitectonic Maps of Mouse Visual Cortex
Author:
Date:
2018-02-20
[Abstract]  This protocol describes a method for registration of in vivo cortical retinotopic map with cytochrome c oxidase (CO) labeled architectonic maps of the same mouse brain through the alignment of vascular fiducials. By recording surface blood vessel pattern and sequential alignment at each step, this method overcomes the challenge imposed by tissue distortion during perfusion, mounting, sectioning and histology procedures. This method can also be generalized to register and align other types of in vivo functional maps like ocular dominance map and spatial/temporal frequency tuning map with various anatomical maps of mouse cortex. [摘要]  该协议描述了通过血管基准点的对齐使用细胞色素c氧化酶(CO)标记的相同小鼠脑的构建图来注册体内皮质视网膜地图的方法。 通过记录每个步骤的表面血管图案和顺序对准,该方法克服了在灌注,贴壁,切片和组织学程序期间由组织变形所施加的挑战。 这种方法也可以推广到注册和对齐其他类型的体内功能地图,如眼优势地图和空间/时间频率调整地图与小鼠皮层的各种解剖图。

【背景】通过体内视网膜映射(Marshel等人,2011; Garrett等人,),可以将小鼠视觉皮层分隔成功能上不同的视觉区域。 (Olavarria and Montero,1989; Wang and Burkhalter,2007),或者通过建筑结构辅助的神经元追踪技术,这些不同的视觉区域具有不同的响应特性和皮质皮质连接(Andermann等人,2011; Marshel等人,2011; Roth等人, >,2012; Wang等人,2011和2012)。这些结果表明,鼠标视觉区域形成处理不同类型的视觉信息的分离的视觉流(Murakami等人,2017; Smith等人,2017)。在视觉区域地图的背景下研究鼠标视觉系统对于理解视觉皮层的组织是至关重要的。然而,虽然功能图和结构图大致相似,但是这两幅图显示的并不完美(Zhuang et ...

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