| An Affinity-directed Protein Missile (AdPROM) System for Targeted Destruction of Endogenous Proteins
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] We recently reported an Affinity-directed PROtein Missile (AdPROM) system for the targeted proteolysis of endogenous proteins of interest (POI) (Fulcher et al., 2016 and 2017). AdPROM consists of the Von Hippel Lindau (VHL) protein, a Cullin 2 E3 ligase substrate receptor (Bosu and Kipreos, 2008), conjugated to a high affinity polypeptide binder (such as a camelid nanobody) that recognises the target protein in cells. When introduced in cells, the target protein is recruited to the CUL2 E3 ubiquitin ligase complex for ubiquitin-mediated proteasomal degradation. For target protein recruitment, we have utilised both camelid-derived VHH domain nanobodies as well as synthetic polypeptide monobodies based on the human type III fibronectin domain (Sha et al., 2013; Fridy et ...
[摘要] 我们最近报道了一种针对内源性感兴趣蛋白（POI）的靶向蛋白水解的亲和指导PROtein导弹（AdPROM）系统（Fulcher等人，2016和2017）。 AdPROM由Von Hippel Lindau（VHL）蛋白组成，Cullin 2 E3连接酶底物受体（Bosu and Kipreos，2008），与识别细胞中靶蛋白的高亲和力多肽结合剂（如骆驼科纳米抗体）缀合。当在细胞中引入时，靶蛋白质被招募到CUL2 E3泛素连接酶复合体用于泛素介导的蛋白酶体降解。对于靶蛋白的募集，我们使用了基于人类III型纤连蛋白结构域的骆驼科动物来源的VHH结构域纳米抗体以及合成多肽单体（Sharm等人，2013; Fridy等人。，2014; Schmidt et al。，2016）。在此协议中，我们描述了生成AdPROM构建体及其在人细胞系中用于靶蛋白质破坏的详细方法。 AdPROM允许对POI进行功能表征，并且其目标蛋白质破坏的效率克服了RNA干扰方法的许多局限性，这些方法需要长时间的治疗并与脱靶效应相关联，而CRISPR / Cas9基因编辑并不总是可行的。
【背景】该协议使人们能够在哺乳动物细胞系中设计，构建和表达AdPROM VHL-nano ...
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| Efficient Generation of Multi-gene Knockout Cell Lines and Patient-derived Xenografts Using Multi-colored Lenti-CRISPR-Cas9
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] CRISPR-Cas9 based knockout strategies are increasingly used to analyze gene function. However, redundancies and overlapping functions in biological signaling pathways can call for generating multi-gene knockout cells, which remains a relatively laborious process. Here we detail the application of multi-color LentiCRISPR vectors to simultaneously generate single and multiple knockouts in human cells. We provide a complete protocol, including guide RNA design, LentiCRISPR cloning, viral production and transduction, as well as strategies for sorting and screening knockout cells. The validity of the process is demonstrated by the simultaneous deletion of up to four programmed cell death mediators in leukemic cell lines and patient-derived acute lymphoblastic leukemia xenografts, in which ...
[摘要] 基于CRISPR-Cas9的敲除策略越来越多地用于分析基因功能。然而，生物信号通路中的冗余和重叠功能可能需要产生多基因敲除细胞，这仍然是一个相对费力的过程。在这里，我们详细介绍了多色LentiCRISPR载体在人体细胞中同时产生单次和多次敲除的应用。我们提供了一个完整的方案，包括指导RNA设计，LentiCRISPR克隆，病毒生产和转导，以及排序和筛选敲除细胞的策略。该过程的有效性通过同时删除白血病细胞系中多达四个程序性细胞死亡介质和来自患者来源的急性淋巴细胞白血病异种移植物，其中单细胞克隆是不可行的。该协议允许任何具有基本细胞生物学设备的实验室，生物安全2级设备和荧光激活细胞分选功能，可在一个月内有效产生单基因和多基因敲除细胞系或原代细胞。
从对细菌基因组中被称为聚簇定期交织的短回文重复（CRISPR）的遗传元件的好奇的初步观察开始（Ishino等人，1987; Mojica等人，2000 ）和随后在哺乳动物细胞中的基因编辑（Cong等人，2013; Mali等人，2013），CRISPR-Cas9已经成为廉价和有效的基因编辑。随着从烟草植物细胞到斑马鱼和原代人类细胞（Hsu等人，2014）的细胞系统的成功应用，CRISPR-Cas9可以通过短的20个核苷酸RNA序列的设计来引导在大基因组内的靶向DNA双链断裂（DSB）（Park等人，2016）。 ...
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| Activity-based Pull-down of Proteolytic Standard and Immunoproteasome Subunits
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Author:
Date:
2016-12-20
[Abstract] Activity-based probes (ABP) are small organic molecules that irreversibly bind to the active center of a specific enzyme family and may be coupled to a fluorophore or an affinity tag (Li et al., 2013). Here, we describe a method to pull-down active catalytic standard and immunoproteasome subunits in cell lysates using the biotinylated, proteasome-specific ABP Biotin-Epoxomicin (Bio-EP). Covalent labeling of the active catalytic subunits with Bio-EP is followed by a pull-down using streptavidin-coated beads. After elution from the beads, enriched subunits may be detected via Western blot, tandem mass spectrometry (Li et al., 2013), or alternative techniques.
[摘要] 基于活性的探针（ABP）是不可逆地结合特定酶家族的活性中心并且可以偶联至荧光团或亲和标签的小有机分子（Li等人，2013）。在这里，我们描述了使用生物素化的蛋白酶体特异性ABP生物素 - 环氧丙素（Bio-EP）在细胞裂解物中下拉活性催化标准和免疫蛋白酶体亚基的方法。用Bio-EP共价标记活性催化亚单位，然后使用链霉抗生物素蛋白包被的珠子进行下拉。从珠中洗脱后，可以通过Western印迹，串联质谱法（Li et al。，2013）或其他技术检测富集的亚单位。
背景 蛋白酶体是存在于真核细胞的细胞核和细胞质中的桶形多分子酶复合物。蛋白质降解是重要的，包括加工MHC I呈递的抗原肽，并调节许多细胞过程（Kammerl和Meiners，2016）。在造血起源的细胞中，标准（组成型）蛋白酶体通常被免疫蛋白酶体（Meiners等人，2014）所替代，其在三种不同的催化活性β-亚基的掺入中不同（图1）。
为了研究单个催化亚基的分子功能并调节生理过程，亚基特异性蛋白酶体抑制剂的发展是必不可少的。 de ...
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