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Glycerol

甘油

Company: Sigma-Aldrich
Catalog#: G5516
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Generating Loss-of-function iPSC Lines with Combined CRISPR Indel Formation and Reprogramming from Human Fibroblasts
Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract]  For both disease and basic science research, loss-of-function (LOF) mutations are vitally important. Herein, we provide a simple stream-lined protocol for generating LOF iPSC lines that circumvents the technical challenges of traditional gene-editing and cloning of established iPSC lines by combining the introduction of the CRISPR vector concurrently with episomal reprogramming plasmids into fibroblasts. Our experiments have produced nearly even numbers of all 3 genotypes in autosomal genes. In addition, we provide a detailed approach for maintaining and genotyping 96-well plates of iPSC clones. [摘要]  对于疾病和基础科学研究而言,功能丧失(LOF)突变是非常重要的。 在这里,我们提供了一个简单的流线化协议来产生LOF iPSC系列,通过将CRISPR载体与附加型重编程质粒同时引入成纤维细胞,规避了传统基因编辑和已建立的iPSC系的克隆的技术挑战。 我们的实验已经产生了常染色体基因中所有3种基因型的几乎偶数。 此外,我们提供了一个详细的方法来维护和iPSC克隆的96孔板的基因分型。

【背景】CRISPR / Cas9技术允许简单且特异地针对特定基因组位置进行基因编辑。将该技术与诱导性多能干细胞(iPSC)的疾病建模和再生医学潜力相结合将继续对生物医学研究产生前所未有的影响。然而,使CRISPR / Cas9系统适应iPSC已经提出了几个挑战。在细胞系中进行基因编辑的传统方法是用表达Cas9蛋白质的质粒和指导RNA(gRNA)转染细胞,然后产生单克隆并筛选所需的遗传改变。不幸的是,iPSC不适用于单细胞克隆。已经开发了几种补充媒介和克隆方法来克服这一困难,但仍然充满昂贵的设备(低氧培养箱),困难的技术步骤(FACS分选的单个iPSC的存活)或劳动密集型方案(亚克隆)(Forsyth ,2006; Miyaoka ...

Guanine Nucleotide Exchange Assay Using Fluorescent MANT-GDP
Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract]  GTPases are molecular switches that cycle between the inactive GDP-bound state and the active GTP-bound state. GTPases exchange nucleotides either by its intrinsic nucleotide exchange or by interaction with guanine nucleotide exchange factors (GEFs). Monitoring the nucleotide exchange in vitro, together with reconstitution of direct interactions with regulatory proteins, provides key insights into how a GTPase is activated. In this protocol, we describe core methods to monitor nucleotide exchange using fluorescent N-Methylanthraniloyl (MANT)-guanine nucleotide. [摘要]  GTP酶是分子开关,在无效GDP结合状态和活性GTP结合状态之间循环。 GTP酶通过其内在的核苷酸交换或通过与鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)的相互作用来交换核苷酸。 监测体外核苷酸交换,以及与调节蛋白直接相互作用的重构,为GTP酶如何被激活提供了重要见解。 在该协议中,我们描述了使用荧光N-甲基呋喃酰基(MANT) - 鸟嘌呤核苷酸来监测核苷酸交换的核心方法。

【背景】GTPase是鸟嘌呤核苷酸结合蛋白,调节细胞过程的广度,从蛋白质生物合成到细胞周期进展,从细胞骨架重组到膜运输。 GTPases可以被认为是分子开关,它在GDP结合“关闭”状态和GTP结合“开启”状态之间循环;在通过GTP的GDP核苷酸交换结合GTP时,GTP酶变得活跃并且将结合下游效应蛋白以招募和激活这些效应子的生物学功能。 GTP酶通过与开关I环(G2结构域)的高度保守苏氨酸和开关II环(G3结构域)的DxxG基序内的甘氨酸的相互作用结合GTP的γ-磷酸。 GTP水解后,与γ-磷酸相互作用的丧失导致动态构象变化,从而使GTPase变为关闭状态(Vetter and ...

CRISPR-mediated Tagging with BirA Allows Proximity Labeling in Toxoplasma gondii
Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract]  Defining protein interaction networks can provide key insights into how protein complexes govern complex biological problems. Here we define a method for proximity based labeling using permissive biotin ligase to define protein networks in the intracellular parasite Toxoplasma gondii. When combined with CRISPR/Cas9 based tagging, this method provides a robust approach to defining protein networks. This approach detects interaction within intact cells, it is applicable to both soluble and insoluble components, including large proteins complexes that interact with the cytoskeleton and unique microtubule organizing center that comprises the apical complex in apicomplexan parasites. [摘要]  定义蛋白质相互作用网络可以为蛋白质复合物如何控制复杂的生物学问题提供关键信息 在这里我们定义了一种基于接近度的标记方法,使用宽容的生物素连接酶来定义细胞内寄生虫弓形虫的蛋白质网络。 当与基于CRISPR / Cas9的标记结合使用时,这种方法提供了一种可靠的方法来定义蛋白质网络。 这种方法检测完整细胞内的相互作用,它适用于可溶性和不可溶性成分,包括与细胞骨架相互作用的大型蛋白质复合物和独特的微管组织中心,其中包括顶尖复合体在顶尖复合寄生虫中。

【背景】分析蛋白质 - 蛋白质相互作用是解决蛋白质如何组装和作为大分子复合物的关键努力。传统上,通过免疫共沉淀(共-IP)和随后的质谱分析已经鉴定出蛋白质复合物。然而,一些蛋白质复合物取代基可能在co-IP的裂解,下拉和洗涤步骤期间人为失去或获得,这对于不溶性膜或需要侵蚀性溶解的结构蛋白质尤其成问题。作为co-IP的替代物,邻近依赖性生物素鉴定(BioID)提供了在正常细胞稳态期间紧邻目标靶蛋白的蛋白质“快照”(Roux等人,2012年)。 BioID利用融合到感兴趣的靶蛋白的混杂的大肠杆菌生物素蛋白连接酶(BirA)。生物素补充使得BirA融合物在30纳米内允许生物素化的近邻生物体(Roux et al。,2012; Van Itallie et al。,2013) ...

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