| FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] We developed a protocol for photoconversion of endocytic marker FM1-43 followed by electron microscopy analysis of synaptic boutons at the Drosophila neuromuscular junction. This protocol allows detection of stained synaptic vesicle even when release rates are very low, such as during the spontaneous release mode. The preparations are loaded with the FM1-43 dye, pre-fixed, treated and illuminated to photoconvert the dye, and then processed for conventional electron microscopy. This procedure enables clear identification of stained synaptic vesicles at electron micrographs.
[摘要] 我们开发了内吞标记FM1-43的光转换方案，然后在果蝇神经肌肉接头处进行突触引物的电子显微镜分析。 即使在释放速率非常低时，例如在自发释放模式期间，该方案允许检测染色的突触小泡。 该制剂装载有FM1-43染料，经预先固定，处理和照射，以使染料转变为染料，然后进行常规电子显微镜处理。 该方法能够在电子显微照片下清楚鉴定染色的突触小泡。
【背景】神经元发射体通过突触小泡与神经元质膜的融合而释放。囊泡可以自发融合或响应动作电位。随后，囊泡通过内吞作用获得回收。通过分子生物学，电生理学和显微镜的工具广泛研究了突触小泡回收的分子机制（Slepnev和De Camilli，2000; Sudhof，2004; Rizzoli和Betz，2005; Kavalali，2006）。加载内参标记FM1-43与染料光转换耦合，然后进行电子显微镜分析是一种强大的技术，允许调查和测量回收囊泡池（Harata et al。，2001; Schikorski and Stevens，2001; Rizzoli和Betz， 2004）。果蝇神经肌肉接头（NMJ）是具有明确定义的突触引物的有利制剂，其能够快速产生具有突变突触蛋白的细胞系和严格评估囊泡回收池（Akbergenova和Bykhovskaia，2009; ...
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| Ubiquitin Proteasome Activity Measurement in Total Plant Extracts
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] The fine-tuned balance of protein level, conformation and location within the cell is vital for the dynamic changes required for a cell to respond to a given stimulus. This requires the regulated turnover of damaged or short-lived proteins through the ubiquitin proteasome system (UPS). Thus, the protease activity of the proteasome is adjusted to meet the current demands of protein degradation via the UPS within the cell. We describe the adaptation of an intramolecular quenched fluorescence assay utilizing substrate-mimic peptides for the measurement of proteasome activity in total plant extracts. The peptide substrates contain donor-quencher pairs that flank the scissile bond. Following cleavage, the increase in dequenched donor emission of the product is subsequently measured over time ...
[摘要] 细胞内的蛋白质水平，构象和位置的微调平衡对于细胞对给定刺激作出反应所需的动态变化是至关重要的。 这需要通过泛素蛋白酶体系统（UPS）调节受损或短寿命蛋白质的周转。 因此，调节蛋白酶体的蛋白酶活性以满足目前通过细胞内的UPS的蛋白质降解的需求。 我们描述了使用底物 - 模拟肽进行分子内淬灭荧光测定来测定总植物提取物中蛋白酶体活性的适应性。 肽底物含有侧向于剪切键的供体 - 猝灭剂对。 切割后，随后随时测量产物的去质子供体发射的增加，并用于计算相对蛋白酶体活性。
【背景】泛素蛋白酶体系统（UPS）是真核细胞中主要的蛋白质降解机制，因此，UPS对许多细胞过程的调节至关重要，包括信号传导，细胞周期，囊泡运输和免疫。用于营业额的蛋白质通过泛素的共价连接标记，然后被26S蛋白酶体降解。 26S蛋白酶体由两个亚颗粒组成，即20S核心蛋白酶（CP），其分隔蛋白酶活性位点和19S调节颗粒，其将适当的底物识别并转移到CP腔中进行分解。调节蛋白酶体活性以维持蛋白酶抑制以响应内部和外部条件的波动。我们最近显示，UPS涉及植物免疫的几个方面，一系列植物和动物病原体颠覆了UPS来增强其毒力（Üstünet al。，2013;üstünet al。，2014;ÜstünandBörnke，2015 ;Üstünet ...
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| Preparation of Crude Synaptosomal Fractions from Mouse Brains and Spinal Cords
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] The current protocol describes the preparation of crude synaptosomal fractions from mouse brain or spinal cord samples. In detail, a sequential protocol yielding crude synaptosomal and light membrane fractions is provided. This fast and easy method might be sufficient to assess the amount of synaptic proteins in down-steam applications like Western-blot or ELISA in e.g., mouse models of Alzheimer’s disease or other neurodegenerative conditions.
[摘要] 目前的方案描述了从小鼠脑或脊髓样品制备粗突触体部分。 详细地，提供了产生粗突触体和轻质膜部分的顺序方案。 这种快速和容易的方法可能足以在例如阿尔茨海默病或其他神经变性病症的小鼠模型中评估下蒸汽应用中的突触蛋白质的量，例如Western印迹或ELISA。
【背景】分析突触体，代表孤立的突触终端从神经元，可以产生有价值的信息，在不同的神经系统疾病的突触完整性。它们含有在特定条件下脑匀浆后从轴突末端脱离的膜结合区。目前的方案描述了一种快速和简便的浓缩粗突变体级分的方法（见图1）。这些可以用于通过蛋白质印迹定量突触蛋白质，或者可以使用密度梯度离心法进一步纯化以产生高度纯化的突触体亚级分（Gurd等人，1974）。粗突触体部分的制备可能足以评估例如的突触前和突触后蛋白如SNAP25或突触后密度蛋白95（PSD95）的量，例如，具有神经变性表型的小鼠模型（Breyhan等人，2009; Saul and Wirths，2017）。
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图1.描述顺序提取过程的流程图
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