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Author:
John Gray, Brett Burdo, Mary P. Goetting-Minesky, Bettina Wittler, Matthew Hunt, Tai Li, David Velliquette, Julie Thomas, Tina Agarwal, Kasey Key, Irene Gentzel, Michael dos Santos Brito, Maria Katherine Mejía-Guerra, Layne N. Connolly, Dalya Qaisi, Wei Li, Maria I. Casas, Andrea I. Doseff and Erich Grotewold,
Date:
2015-08-05
[Abstract] The construction of a physical collection of open reading frames (ORFeomes) for genes of any model organism is a useful tool for the exploration of gene function, gene regulation, and protein-protein interaction. Here we describe in detail a protocol that has been used to develop the first collection of transcription factor (TF) and co-regulator (CR) open reading frames (TFome) in maize (Burdo et al., 2014). This TFome is being used to establish the architecture of gene regulatory networks (GRNs) responsible for the control of transcription of all genes in an organism. The protocol outlined here describes how to proceed when only an incomplete genome with partial annotation is available. TFome clones are made in a recombination-ready vector of the Gateway? system, ...
[摘要] 任何模式生物的基因的开放阅读框（ORFeomes）的物理集合的构建是探索基因功能，基因调节和蛋白质 - 蛋白质相互作用的有用工具。在这里我们详细描述已经用于开发玉米中转录因子（TF）和共调节子（CR）开放阅读框（TFome）的第一集合的方案（Burdo等人， 2014）。该TFome用于建立基因调控网络（GRN）的架构，负责控制生物体中所有基因的转录。这里概述的协议描述如何进行时，只有一个不完整的基因组与部分注释可用。 TFome克隆在Gateway系统的重组准备好的载体中制备，允许ORF容易地转移到其它Gateway载体 - 例如那些合适的载体上用于在其他宿主物种中表达。虽然这个协议是为玉米TFome开发的，它可以很容易地应用于在其他真核物种中产生完整的ORFeome集合。
[Protocol overview] 成功的一个重要方面TFome代是用于建立可靠的一组基因模型的初始努力，使得它们随后可以被扩增或合成。用于特定物种的实际TFome构建方案将取决于可获得的资源，例如全长cDNA（flcDNA）收集和可靠的参考基因组（图1）。
在玉米的情况下，可获得flcDNA集合和基因组草图，但前者仅提供所需克隆的30％，后者含有缺口和一些错误的基因模型。为了开发用于玉米TF的接近完整的靶基因模型组，开发了如Yilmaz等人（2009）所述的生物信息学管道。简而言之，开发了一个双管齐下的搜索过程。第一个涉及在其他物种中制备TF的蛋白质序列的集合，并且可从数据库例如PlantTFDB，PlnTFDB和DBDTF获得。然后使用BLASTP将这些序列用于从玉米基因组草稿中搜索基因模型。第二个过程涉及开发定义TF家族并且在PFAM数据库中大多注释的域的集合（Finn等人，2014）。然后使用BLASTX将这些结构域用于搜索玉米基因组草图。存在的TF家族的数量及其命名可随着新成员被发现和研究而改变。表1提供了具有替代名称的已知TF家族的列表以及相应的PFAM域，其存在或不存在定义每个TF家族。可以从PFAM数据库（ ...
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Author:
Date:
2014-08-20
[Abstract] Small interfering RNAs (siRNAs) are small (typically 18-24 nucleotides) RNA molecules capable of silencing gene expression post-transcriptionally and as such, they provide a simple method by which the role of individual genes in complex cellular systems can be easily assessed. As siRNAs are easy to use experimentally, and can be designed to target any gene (including pathogens), their use is perfectly suited to and easily adapted to high-throughput genome-wide screening methodologies and a range of phenotypic assays. Here we describe the use of a large siRNA library (>8,000 genes targeted individually) to screen for and identify host factors functionally involved in the replication of a human herpesvirus (Herpes simplex virus type 1; HSV-1) (Griffiths et al., 2013; Griffiths, ...
[摘要] 小干扰RNA（siRNA）是能够沉默转录后基因表达的小（通常为18-24个核苷酸）RNA分子，因此，它们提供了一种简单的方法，通过其可以容易地评估单个基因在复杂细胞系统中的作用。 由于siRNA易于实验使用，并且可以设计为靶向任何基因（包括病原体），它们的使用完全适合于并且容易地适应于高通量全基因组筛选方法学和一系列表型测定。 这里我们描述了使用大的siRNA文库（> 8,000个基因单独靶向）来筛选和鉴定功能上涉及人疱疹病毒（1型单纯疱疹病毒; HSV-1）（Griffiths）的复制的宿主因子， et al。，2013; Griffiths，2013）。
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