| Fusarium graminearum Double (Triple) Mutants Generation Using Sexual Crosses
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Author:
Date:
2018-08-05
[Abstract] Fusarium graminearum is a destructive phytopathogen that infects major cereal crops such as wheat, maize and barley. Double or triple mutants are often very useful in the phenotypic and genetic analysis of genes that function redundantly or within similar pathways. When single gene mutants are available, double or triple mutants can be generated by crossing heterothallic strains or multiple rounds of protoplast transformation. When individual mutants carry different antibiotic resistance, it is convenient to use the sexual crossing to generate desired recombinant strains. Here, we present a protocol for generating double or triple mutants by sexual crossing in one homothallic strain with further antibiotic resistance and genomic DNA PCR screening of recombinant progenies.
[摘要] 禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）是一种破坏性的植物病原体，可感染小麦，玉米和大麦等主要谷类作物。 双重或三重突变体通常在冗余或相似途径内起作用的基因的表型和遗传分析中非常有用。 当可获得单基因突变体时，可通过杂交异源菌株或多轮原生质体转化产生双突变体或三突变体。 当单个突变体携带不同的抗生素抗性时，使用有性杂交方便产生所需的重组菌株是方便的。 在这里，我们提出了一种方案，通过在一个同源的菌株中通过有性杂交产生双突变体或三突变体，具有进一步的抗生素抗性和重组后代的基因组DNA PCR筛选。
【背景】子囊菌真菌镰刀菌（Fusarium graminearum）是一种破坏性的植物病原体，可引起谷类食物的头部枯萎病，穗腐病，茎腐病和冠。它可以在胡萝卜琼脂体外产生perithecia 。该测定法可用于研究子囊膜发育，子囊孢子放电和性重组（Nicholson，2007）。
F。禾本科植物是同源的，具有MAT1-1和MAT1-2-1基因座;这些基因座缺失突变体中的每一个在自交中都是无菌的（Zheng et al。，2013）。为了产生双基因突变体，一个单基因突变体传统上与 MAT 缺失突变体杂交，并进一步与另一个突变体杂交（Bowden和Leslie，1999; Lee et al。 ，2011; Son et ...
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| Genome Editing in Diatoms Using CRISPR-Cas to Induce Precise Bi-allelic Deletions
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Date:
2017-12-05
[Abstract] Genome editing in diatoms has recently been established for the model species Phaeodactylum tricornutum and Thalassiosira pseudonana. The present protocol, although developed for T. pseudonana, can be modified to edit any diatom genome as we utilize the flexible, modular Golden Gate cloning system. The main steps include how to design a construct using Golden Gate cloning for targeting two sites, allowing a precise deletion to be introduced into the target gene. The transformation protocol is explained, as are the methods for screening using band shift assay and/or restriction site loss.
[摘要] 最近为三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）和海绵假丝酵母（Thalassiosira pseudonana）建立了硅藻基因组编辑。 目前的协议，虽然开发的 T。 pseudonana ，可以修改编辑任何硅藻基因组，因为我们利用灵活，模块化的金门克隆系统。 主要步骤包括如何设计构建使用金门克隆靶向两个网站，允许一个精确的删除被引入目标基因。 解释转化方案，以及使用带移位测定和/或限制性位点丢失进行筛选的方法。
【背景】CRISPR-Cas正在迅速成为分子研究的一个关键方法。基于在细菌和古细菌中发现的病毒防御机制，CRISPR-Cas诱导基因组中精确位置的双链断裂（DSBs）。它涉及使用与CRISPR ...
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| Uptake Assays in Xenopus laevis Oocytes Using Liquid Chromatography-mass Spectrometry to Detect Transport Activity
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Author:
Date:
2017-10-20
[Abstract] Xenopus laevis oocytes are a widely used model system for characterization of heterologously expressed secondary active transporters. Historically, researchers have relied on detecting transport activity by measuring accumulation of radiolabeled substrates by scintillation counting or of fluorescently labelled substrates by spectrofluorometric quantification. These techniques are, however, limited to substrates that are available as radiolabeled isotopes or to when the substrate is fluorescent. This prompted us to develop a transport assay where we could in principle detect transport activity for any organic metabolite regardless of its availability as radiolabeled isotope or fluorescence properties.
In this protocol we describe the use of X. laevis oocytes ...
[摘要] 非洲爪蟾卵母细胞是用于表征异源表达的第二活性转运蛋白的广泛使用的模型系统。历史上，研究人员依靠通过闪烁计数或荧光标记的底物通过分光荧光定量测量放射性标记底物的积累来检测运输活动。然而，这些技术仅限于可用作放射性标记的同位素的底物或当底物是荧光时。这促使我们开发了一种运输测定法，我们可以原则上检测任何有机代谢物的转运活性，无论其作为放射性标记的同位素或荧光性质如何。
在这个协议中，我们描述了X的使用。卵母细胞作为表达次要活性转运蛋白的异源宿主，以及如何进行摄取测定，然后通过液相色谱 - 质谱（LC-MS）检测和定量运输的代谢物。我们已经成功地使用这种方法来鉴定和表征称为硫代葡萄糖苷和氰基葡糖苷的植物防御代谢物的转运蛋白（Jørgensen等人，2017），然而该方法可用于表征任何转运蛋白底物可以通过LC-MS检测。
【背景】来自非洲爪蟾蛙（Xenopus laevis）的卵母细胞是用于异源表达和表征膜蛋白（即，转运蛋白和通道）的完整表达系统。 X。卵母细胞表达少量内源性膜蛋白，具有低的背景转运活性。此外，来自植物的次要活性转运蛋白（Boorer等人，1992; Theodoulou和Miller，1995; Nour-Eldin等人，2006），动物（Sumikawa 1981）; ...
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