| Expansion of Airway Basal Cells and Generation of Polarized Epithelium
|
|
Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] Airway basal stem cells are the progenitor cells within the airway that exhibit the capacity to self-renew and give rise to multiple types of differentiated airway epithelial cells. This stem cell-derived epithelium displays organized architecture with functional attributes of the airway mucosa. A protocol has been developed to culture and expand human airway basal stem cells while preserving their stem cell properties and capacity for subsequent mucociliary differentiation. This achievement presents a previously unrealized opportunity to maintain a durable supply of progenitor cells derived from healthy donors to differentiate into human primary airway epithelium for cellular and molecular-based studies. Further, basal stem cells can be harvested from patients with a specific airway ...
[摘要] 气道基底干细胞是气道内的祖细胞，表现出自我更新的能力并产生多种类型的分化的气道上皮细胞。这种干细胞来源的上皮细胞显示出具有气道粘膜功能属性的有组织的结构。已经开发了一种方案来培养和扩展人气道基底干细胞，同时保持其干细胞特性和后续粘液分泌的能力。这项成就提供了一个以前未实现的机会，以保持源自健康供体的祖细胞的持久供应，以分化为用于基于细胞和分子的研究的人原发性气道上皮。此外，基底干细胞可以从患有特定气道疾病的患者（例如囊性纤维化）中收集，从而能够在适当的气道粘膜环境下研究疾病特异性细胞的潜在改变的行为。在这里，我们详细描述了一系列气道基底干细胞系列扩增的方案，以实现几乎无限制的气道基底细胞的生成，这些细胞可以储存并随时用于随后的培养和分化。此外，我们描述了气液基底干细胞在空气 - 液体界面处的可渗透Transwell过滤器上的培养和分化，以创建功能性粘膜睫毛伪分层极化气道上皮粘膜。
【背景】气道疾病建模和药物发现已经从在气液界面（ALI）的可渗透Transwell过滤器上生长的原代呼吸道上皮培养物的开发和使用中获益。与永生化细胞系相比，该模型具有几个优点，即原代上皮细胞可以分化成具有多种上皮细胞类型（包括纤毛，浆膜和基底细胞）的气道粘膜，并且它们的排列在体内是相当反映的蜂窝组织。主要的ALI模型表现出功能性微生理过程，包括跳动纤毛和分泌粘液的能力，这些特征在细胞系衍生的上皮单层中显着不存在。此外，原代细胞不依赖于人工永生化或转化，因为细胞系来源的上皮细胞确实存在，因此不受细胞系中可能发生的错误信号传导的阻碍，这可能会错误地表示气道上皮中发生的过程。尽管有这些显着的限制，永生化细胞系被广泛用于模拟和研究气道上皮细胞，因为原发性气道上皮细胞存在自己的一系列挑战。原代上皮细胞在传代数次后无法复制，必须连续收获并分离以完成每组研究。另外，改变或缺失感兴趣基因表达的分子生物学技术难以实现，并且与原代上皮细胞一起维持。这些缺点造成成本和技术障碍，阻碍了原发性ALI培养物的广泛使用，尽管它们在调查气道粘膜方面有明显优势。 ...
|
|
|
| A Method for Extracting the Nuclear Scaffold from the Chromatin Network
|
|
Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract] Each cell contains many large DNA polymers packed in a nucleus of approx. 10 μm in diameter. With histones, these DNA polymers are known to form chromatins. How chromatins further compact in the nucleus is unclear but it inevitably depends on an extensive non-chromatin nuclear scaffold. Imaging of endogenous chromatin network and the complementary scaffold that support this network has not been achieved but biochemical and proteomic investigations of the scaffold can still provide important insights into this chromatin-organizing network. However, this demands highly inclusive and reproducible extraction of the nuclear scaffold. We have recently developed a simple protocol for releasing the scaffold components from chromatins. The inclusiveness of the extract was testified by the ...
[摘要] 每个细胞都含有许多大型DNA聚合物，其中包含大约一个核。直径10微米。用组蛋白，已知这些DNA聚合物形成染色质。染色质在核中如何进一步致密还不清楚，但它不可避免地依赖于广泛的非染色质核支架。内源性染色质网络的成像和支持该网络的互补支架尚未实现，但支架的生化和蛋白质组学研究仍然可以提供关于该染色质组织网络的重要见解。但是，这需要高度包容和可重复的提取核支架。我们最近开发了一个简单的协议，用于从染色质中释放脚手架组件。提取物的包容性由以下观察结果证实：当从核中提取时，剩余的核染色质被释放为延伸且通常平行的染色质纤维。基本上，该方案包括纯核的产生，用Triton X-100处理细胞核以产生包膜消耗的细胞核（TxN），并在含蔗糖的缓冲液中在500mM NaCl中提取细胞核。 TxN的这个组合提取被称为TxNE。
【背景】通过蛋白质和核糖核蛋白的复杂支架，染色质在细胞核中密集并动态地压缩。与细胞骨架网络不同（Fischer和Fowler，2015），对这种核支架的显微观察在技术上是具有挑战性的。这可能反映了每个细胞核内染色质的主导地位，支架与细胞核交织在一起。核的球形排列也对成像这种支架结构造成挑战。核支架的主要元素是核层（NL）（Gruenbaum和Foisner，2015）。 ...
|
|
|
| In vitro Chondrogenic Hypertrophy Induction of Mesenchymal Stem Cells
|
|
Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] To investigate underlying mechanism of chondrogenic hypertrophy, we need proper in vitro hypertrophic model of mesenchymal stem cells (MSCs). This protocol describes our defined method for induction of in vitro chondrogenic hypertrophy of human umbilical cord blood-derived MSCs (hUCB-MSCs). By adding thyroid hormone (T3; triiodothyronine) and minimum osteogenic-inducing factors to culture medium, we could induce hypertrophy of hUCB-MSCs in vitro. Hypertrophic induction was validated using immunohistochemical analysis, Western blotting and reverse transcriptase polymerase chain reaction.
[摘要] 为了研究软骨形成性肥大的基础机制，我们需要适当的体外间充质干细胞（MSC）的增生模型。该协议描述了我们定义的诱导人脐带血衍生的MSC（hUCB-MSC）的体外软骨形成性肥大的方法。通过将甲状腺激素（T3;三碘甲状腺原氨酸）和最小成骨诱导因子添加到培养基中，我们可以在体外诱导hUCB-MSCs的增生。使用免疫组织化学分析，Western印迹和逆转录酶聚合酶链反应验证肥大性诱导。
关键词：间充质干细胞，体外软骨形成性肥大，成软骨分化，三碘甲腺原氨酸;
[背景] ...
|
|
|