| Single-molecule Analysis of DNA Replication Dynamics in Budding Yeast and Human Cells by DNA Combing
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Author:
Date:
2017-06-05
[Abstract] The DNA combing method allows the analysis of DNA replication at the level of individual DNA molecules stretched along silane-coated glass coverslips. Before DNA extraction, ongoing DNA synthesis is labeled with halogenated analogues of thymidine. Replication tracks are visualized by immunofluorescence using specific antibodies. Unlike biochemical and NGS-based methods, DNA combing provides unique information on cell-to-cell variations in DNA replication profiles, including initiation and elongation. Finally, this assay can be used to monitor the effect of DNA lesions on fork progression, arrest and restart.
[摘要] DNA梳理方法允许在沿着硅烷涂覆的玻璃盖玻片拉伸的单个DNA分子的水平上分析DNA复制。在DNA提取前，进行的DNA合成用胸苷的卤化类似物标记。使用特异性抗体通过免疫荧光可视化复制轨迹。与生物化学和基于NGS的方法不同，DNA梳理提供了DNA复制谱中细胞间细胞变化的独特信息，包括引发和延长。最后，该测定可用于监测DNA损伤对叉进展，停止和重新启动的影响。
背景 在称为复制起点的真核染色体上的数千个位点处启动DNA合成。原始激活遵循由检查点激酶和染色质的表观遗传修饰（Prioleau和MacAlpine，2016）控制的定义良好的复制计时程序。复制叉在正常S阶段经常停顿。叉停止是由多个事件引起的，例如DNA损伤，紧密结合的蛋白质复合物和高表达基因的转录（Tourriere和Pasero 2007; Zeman and Cimprich，2013）。真核生物已经制定了不同的策略来应对这种复制压力，包括修复机制来重新启动捕获的叉子和激活休眠复制起源以抢救终末抓捕的叉。
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| 59Fe Uptake Assays in Paracoccidioides Species
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Author:
Date:
2016-09-20
[Abstract] Iron is an essential micronutrient required for virtually all organisms. This fact is related to the ability of the transition metal to exist in two oxidation states, the reduced ferrous (Fe2+) and the oxidized ferric (Fe3+). Given the relative availability of aqueous iron (the element which constitutes ~5% of the earth’s crust) one is not surprised that iron is the most common prosthetic element in biology. Usually, fungi can uptake iron through receptor-mediated internalization of a siderophore or heme, and/or reductive iron assimilation (RIA) (Kosman, 2013). In this way, the uptake of iron in the absence or presence of the reducing agent ascorbic acid can be investigated by 59Fe uptake assays, as previously described (Eide et al., 1992). In the ...
[摘要] 铁是几乎所有生物体所必需的微量营养素。这一事实涉及过渡金属以两种氧化态存在的能力，即还原的亚铁（Fe 2+）和氧化的铁（Fe 3++）。考虑到铁水（构成地壳的〜5％的元素）的相对可用性，人们不惊讶的是，铁是生物学中最常见的假体元素。通常，真菌可以通过受体介导的铁载体或血红素的内化，和/或还原铁同化（RIA）吸收铁（Kosman，2013）。以这种方式，如上所述，可以通过59 Fe吸收测定来研究在还原剂抗坏血酸存在或不存在下铁的吸收（Eide等人）。 ，1992）。在抗坏血酸存在下，研究还原非依赖性59 Fe吸收途径。另一方面，在不存在抗坏血酸的情况下，刺激还原依赖性59 Fe吸收途径。使用这种策略用于人类致病真菌Paracoccidioides物种，结果表明，在没有抗坏血酸的情况下，通过 01的铁摄取是低的，不同于在 > Pb 18。这些结果表明，只有在Fe 18中，铁摄取路径与铁还原酶偶联（Bailão等人，2015）。在该方案中，我们描述了如何在Paracoccidioides物种中进行 59 Fe摄取测定。
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