| Studying the Mechanisms of Developmental Vocal Learning and Adult Vocal Performance in Zebra Finches through Lentiviral Injection
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Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] Here we provide a detailed step-by-step protocol for using lentivirus to manipulate miRNA expression in Area X of juvenile zebra finches and for analyzing the consequences on song learning and song performance. This protocol has four parts: 1) making the lentiviral construct to overexpress miRNA miR-9; 2) packaging the lentiviral vector; 3) stereotaxic injection of the lentivirus into Area X of juvenile zebra finches; 4) analysis of song learning and song performance in juvenile and adult zebra finches. These methods complement the methods employed in recent works that showed changing FoxP2 gene expression in Area X with lentivirus or adeno-associated virus leads to impairments in song behavior.
[摘要] 在这里，我们提供了一个详细的逐步协议，用于使用慢病毒操纵幼年斑胸草雀X区的miRNA表达，并分析对歌曲学习和歌曲表现的影响。 该方案有四个部分：1）使慢病毒构建体过表达miRNA miR-9; 2）包装慢病毒载体; 3）将慢病毒立体定位注入少年斑胸草雀X区; 4）青少年和成年斑马雀的歌曲学习和歌曲表演分析。 这些方法补充了近期工作中使用的方法，这些方法显示，在区域X中用慢病毒或腺相关病毒改变 FoxP2 基因表达导致歌曲行为的损害。
【背景】具有良好特征的歌曲行为和基础神经回路的斑胸草雀提供了独特的动物模型来研究声音通信和相关感觉 - 运动学习的神经机制。近年来，一些实验室开始使用病毒载体来操纵斑胸草雀脑中的基因表达并研究其功能后果。这些努力通过对 FoxP2 基因的研究得到了最好的说明，该基因编码叉头盒p2转录因子。 FoxP2蛋白控制着数百个在神经系统发育中起重要作用的下游基因的表达。人类 FoxP2 基因的突变导致言语和语言障碍（Lai et al。，2001）。在鸣禽中，斑马雀X区域的 FoxP2 基因的敲除或过表达，对于声乐学习至关重要的基底神经节核，严重损害了歌曲的行为（Haesler et al。， 2007; Murugan et al。，2013; Heston and ...
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| CRISPR-mediated Tagging with BirA Allows Proximity Labeling in Toxoplasma gondii
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] Defining protein interaction networks can provide key insights into how protein complexes govern complex biological problems. Here we define a method for proximity based labeling using permissive biotin ligase to define protein networks in the intracellular parasite Toxoplasma gondii. When combined with CRISPR/Cas9 based tagging, this method provides a robust approach to defining protein networks. This approach detects interaction within intact cells, it is applicable to both soluble and insoluble components, including large proteins complexes that interact with the cytoskeleton and unique microtubule organizing center that comprises the apical complex in apicomplexan parasites.
[摘要] 定义蛋白质相互作用网络可以为蛋白质复合物如何控制复杂的生物学问题提供关键信息 在这里我们定义了一种基于接近度的标记方法，使用宽容的生物素连接酶来定义细胞内寄生虫弓形虫的蛋白质网络。 当与基于CRISPR / Cas9的标记结合使用时，这种方法提供了一种可靠的方法来定义蛋白质网络。 这种方法检测完整细胞内的相互作用，它适用于可溶性和不可溶性成分，包括与细胞骨架相互作用的大型蛋白质复合物和独特的微管组织中心，其中包括顶尖复合体在顶尖复合寄生虫中。
【背景】分析蛋白质 - 蛋白质相互作用是解决蛋白质如何组装和作为大分子复合物的关键努力。传统上，通过免疫共沉淀（共-IP）和随后的质谱分析已经鉴定出蛋白质复合物。然而，一些蛋白质复合物取代基可能在co-IP的裂解，下拉和洗涤步骤期间人为失去或获得，这对于不溶性膜或需要侵蚀性溶解的结构蛋白质尤其成问题。作为co-IP的替代物，邻近依赖性生物素鉴定（BioID）提供了在正常细胞稳态期间紧邻目标靶蛋白的蛋白质“快照”（Roux等人，2012年）。 BioID利用融合到感兴趣的靶蛋白的混杂的大肠杆菌生物素蛋白连接酶（BirA）。生物素补充使得BirA融合物在30纳米内允许生物素化的近邻生物体（Roux et al。，2012; Van Itallie et al。，2013） ...
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| Design of Hybrid RNA Polymerase III Promoters for Efficient CRISPR-Cas9 Function
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] The discovery of the CRISPR-Cas9 system from Streptococcus pyogenes has allowed the development of genome engineering tools in a variety of organisms. A frequent limitation in CRISPR-Cas9 function is adequate expression levels of sgRNA. This protocol provides a strategy to construct hybrid RNA polymerase III (Pol III) promoters that facilitate high expression of sgRNA and improved CRISPR-Cas9 function. We provide selection criteria of Pol III promoters, efficient promoter construction methods, and a sample screening technique to test the efficiency of the hybrid promoters. A hybrid promoter system developed for Yarrowia lipolytica will serve as a model.
[摘要] 来自化脓性链球菌的CRISPR-Cas9系统的发现使得在各种生物体中开发基因组工程工具成为可能。 CRISPR-Cas9功能的频繁限制是足够的sgRNA表达水平。 该协议提供了构建杂合RNA聚合酶III（Pol III）启动子的策略，其促进sgRNA的高表达和改善的CRISPR-Cas9功能。 我们提供Pol III启动子的选择标准，有效的启动子构建方法以及样品筛选技术来检测杂合启动子的效率。 为解脂耶氏酵母开发的杂交启动子系统将用作模型。
【背景】CRISPR（成簇定期间隔短回文重复序列）是细菌中发现的DNA序列的集合，其中含有先前曝光的病毒DNA片段（Marraffini和Sontheimer，2010）。片段被称为间隔区DNA，并且它们侧面是短的，重复的回文序列。细菌使用这些存储的间隔序列作为模板来表达RNA，以识别和攻击再次暴露的特定病毒。当与CRISPR相关（Cas）蛋白结合时，CRISPR-Cas系统可以识别和切割外源DNA或RNA，破坏病毒并保护宿主免受重复感染（Barrangou，2013）。
一种特定的CRISPR系统，来自化脓链球菌的II型CRISPR-Cas9已经被修改成用于基因组编辑的更简单的系统。利用这个系统，研究人员能够设计特定的单引导RNA（sgRNA）序列，它与具有上游原型间隔区相邻基序（PAM;'NGG'）的目的基因的20bp序列互补（Jinek ...
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