| Infection of Caenorhabditis elegans with Vesicular Stomatitis Virus via Microinjection
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] Over the past 15 years, the free-living nematode, Caenorhabditis elegans has become an important model system for exploring eukaryotic innate immunity to bacterial and fungal pathogens. More recently, infection models using either natural or non-natural nematode viruses have also been established in C. elegans. These models offer new opportunities to use the nematode to understand eukaryotic antiviral defense mechanisms. Here we report protocols for the infection of C. elegans with a non-natural viral pathogen, vesicular stomatitis virus (VSV) through microinjection. We also describe how recombinant VSV strains encoding fluorescent or luciferase reporter genes can be used in conjunction with simple fluorescence-, survival-, and luminescence-based assays to ...
[摘要] 在过去的15年中，线虫自由生活已经成为探索真核细菌和真菌病原体真核免疫的重要模型系统。 最近，使用天然或非天然线虫病毒的感染模型也已经在C中建立。线虫。 这些模型提供了使用线虫了解真核抗病毒防御机制的新机会。 在这里，我们报告感染的协议。 线虫与非天然病毒病原体，水泡性口炎病毒（VSV）通过显微注射。 我们还描述了编码荧光或萤光素酶报告基因的重组VSV毒株如何与简单的基于荧光，存活和发光的分析结合使用来鉴定宿主遗传背景，并对病毒感染有不同的易感性。
【背景】由于它的遗传易用性，体积小，文化价廉，透明的身体，自由生活的线虫秀丽隐杆线虫作为模式生物提供了许多优点。此外，C的易感性。线虫对人类多种细菌和真菌病原体的作用使得这种蠕虫成为研究微生物发病机制的有吸引力的系统（Zhang和Hou，2013; Cohen and Troemel，2015）。最近，发现了正义ssRNA奥赛病毒（OV）作为第一种天然的病毒病原体。线虫已经提示使用OV- C。 elegans 模型来定义线虫抗病毒防御机制（Felix等人，2011; Gammon，2017）。这些研究已经证明了线虫抗病毒RNA干扰途径组分如Dicer相关解旋酶1（DRH-1）在限制病毒复制中的明确作用（Ashe等人，2013）。
为了补充OV模型系统，我们最近报道了新一代病毒的产生。使用反义ssRNA水泡性口炎病毒（VSV）（Gammon等人，2017）的线虫模型。用VSV感染野生型（N2）蠕虫是致命的，虽然抗病毒反应（例如突变体，drh-1突变体）突变体缺陷会更快地感染感染（Gammon ...
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| Non-radioactive in vitro PINK1 Kinase Assays Using Ubiquitin or Parkin as Substrate
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Date:
2016-10-05
[Abstract] This protocol describes the in vitro phosphorylation of ubiquitin and Parkin by the kinase PINK1 using recombinant proteins. Both substrates, ubiquitin and Parkin, are phosphorylated at the conserved serine 65 residue (pS65-ubiquitin and pS65-Parkin). The protocol also includes the use of monomeric and K48- and K63-linked poly-ubiquitin chains as alternative substrates. Although there are commercially available antibodies, we have not tested their performance in this assay since, but used validated antibodies from our laboratory. An alternative antibody-independent method, the use of phos-tag gels to detect pS65-ubiquitin and pS65-Parkin, is described in addition.
[摘要] 该协议描述了通过激酶PINK1使用重组蛋白的泛素和帕金蛋白的体外磷酸化。两种底物，泛素和帕金蛋白，在保守的丝氨酸65残基（pS65-泛素和pS65-帕金蛋白）上磷酸化。该方案还包括使用单体和K48和K63连接的聚泛素链作为替代底物。虽然有市售的抗体，我们没有测试他们在这个测定中的性能，因为，但使用我们实验室的验证抗体。另外描述了另一种抗体非依赖性方法，使用phos-标记凝胶检测pS65-泛素和pS65-帕金。
[背景] 在细胞中， PINK1是稳定和激活的线粒体膜去极化和其他形式的应力，导致线粒体损伤。活化的PINK1磷酸化泛素，其作为线粒体表面上胞质E3泛素连接酶Parkin的受体。 Parkin对PINK1的磷酸化是Parkin对线粒体底物的完全活性所必需的。活性pS65-Parkin的存在在前馈机制中扩增了作为线粒体标记的线粒体上的pS65-泛素的量。最终，受损的线粒体被自噬噬菌体衔接子识别，并将被蛋白酶体和自噬（mitophagy）降解。这种关键的线粒体质量控制通路促进线粒体的周转，并防止可导致细胞变性的功能障碍线粒体的积累。 PINK1或Parkin中的功能缺失突变与早发性帕金森病相关。
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