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Author:
Date:
2016-09-20
[Abstract] Recently, we identified two host cell-derived proteins as novel stimulatory factors of influenza virus RNA replication process, termed “Influenza virus REplication Factor-2 (IREF-2)”, from human nuclear extracts (NEs) by employing biochemical complementation assays (Sugiyama et al., 2015). Herein, we describe detailed methods for successive procedures for identification and purification of IREF-2, including large-scale suspension culture of HeLa S3 cells, preparation of NEs and separation of IREF-2 by sequential column chromatography steps. This protocol can be modified and used for purification and identification of the other unknown nuclear protein(s) of your interest.
[摘要] 最近，我们通过使用生物化学互补试验（Sugiyama），从人类核提取物（NE）鉴定了两种宿主细胞衍生蛋白作为流感病毒RNA复制过程的新型刺激因子，称为“流感病毒复制因子-2（IREF-2）” et al。，2015）。 本文描述了用于IREF-2鉴定和纯化的连续方法的详细方法，包括HeLa S3细胞的大规模悬浮培养，NE的制备和顺序柱色谱步骤分离IREF-2。 该方案可以修改并用于纯化和鉴定您感兴趣的其他未知核蛋白。
【背景】甲型流感病毒基因组由8个分段和单链RNA（vRNA）组成。其转录和复制由病毒编码的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）催化。几条证据表明某些宿主衍生因子调节病毒RNA合成（Nagata et al。，2008）。最近，通过相互作用分析和基因组RNAi筛选研究，已经报道了各种宿主衍生的蛋白质作为与病毒RNA合成相关的调节因子候选物。然而，其中包括间接涉及病毒RNA合成的一些假阳性相互作用因子和因子。相反，为了鉴定在病毒RNA合成过程中发挥直接作用的可靠和重要的宿主因子，我们使用了生物化学互补测定系统。在该系统中，在感染的细胞核中有效发生的病毒vRNA复制反应被解剖并在体外使用病毒RNA复制所必需的病毒因子重构，例如衍生自洗涤剂溶解的病毒颗粒的病毒RdRP和模型病毒基因组RNA模板和未感染的核提取物（NE）。
最近，我们已经报道，在体外用病毒因子和NE的粗制部分再现有效的vRNA复制（Sugiyama等，2015）。 ...
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Date:
2015-05-05
[Abstract] Multiple viruses can co-infect the genital tract, modifying the immunologic and virologic milieu and possibly playing a role in viral transmission and pathogenesis. The aim of our studies has been to understand the complex relationships between HIV-1 RNA, and multiple human herpesviruses known to frequently replicate in the genital tract of HIV-infected men (i.e. cytomegalovirus [CMV], Epstein Bar virus [EBV], herpes simplex virus [HSV] types 1 and 2, and human herpesviruses [HHV] 6, 7 and 8) (Gianella et al., 2013a; Gianella et al., 2013b; Gianella et al., 2013c; Gianella et al., 2014). This protocol was designed to collect and process male genital secretion (GS), and to isolate and further quantify HIV RNA and DNA of seven HHV from seminal ...
[摘要] 多种病毒可以共感染生殖道，修改免疫学和病毒学环境，并可能在病毒传播和发病中起作用。 我们的研究的目的是了解HIV-1 RNA和已知在HIV感染的男性生殖道中经常复制的多种人疱疹病毒之间的复杂关系（即巨细胞病毒[CMV]，Epstein 条形病毒[EBV]，单纯疱疹病毒[HSV] 1型和2型，以及人疱疹病毒[HHV] 6,7和8）（Gianella等人，2013a; Gianella等人 。，2013b; Gianella 等人，2013c; Gianella ，2014）。 该方案设计用于收集和处理男性生殖器分泌（GS），并使用定量实时PCR技术从精浆中分离并进一步定量7个HHV的HIV RNA和DNA。
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