| Analysis of Replicative Intermediates of Adeno-associated Virus through Hirt Extraction and Southern Blotting
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Author:
Date:
2017-05-05
[Abstract] Adeno-associated virus (AAV) is a small single-stranded DNA virus that requires the presence of a helper virus, such as adenovirus or herpes virus, to efficiently replicate its genome. AAV DNA is replicated by a rolling-hairpin mechanism (Ward, 2006), and during replication several DNA intermediates can be detected. This detailed protocol describes how to analyze the AAV DNA intermediates formed during AAV replication using a modified Hirt extract (Hirt, 1967) procedure and Southern blotting (Southern, 1975).
[摘要] 腺相关病毒（AAV）是一种小型单链DNA病毒，需要存在辅助病毒，如腺病毒或疱疹病毒，以有效地复制其基因组。 AAV DNA通过滚转发夹机制（Ward，2006）进行复制，并且在复制期间可以检测出几种DNA中间体。该详细方案描述了如何使用改良的Hirt提取物（Hirt，1967）程序和Southern印迹（Southern，1975）分析在AAV复制期间形成的AAV DNA中间体。
背景 AAV DNA复制通过滚动发夹机制在由AAV和辅助病毒如腺病毒或疱疹病毒共感染的细胞中进行（Ward，2006）。 AAV DNA由4.7kb的线性DNA分子和倒置的末端重复（ITR）组成，折叠形成T形发夹结构。 3'末端发夹作为AAV DNA复制的引物。这些发夹结构由AAV Rep蛋白再生，允许进一步复制（Im和Muzyczka，1990）。 AAV DNA的+和 - 链都被包装并且是感染性的（Rose等人，1969）。当分析复制AAV DNA时，可以检测到几种复制中间体（Straus等人，1976）。最丰富的复制中间体是由AAV DNA的一个和一个链形成的线性单体双链体分子，其被认为是将包装在预先形成的衣壳中的后代单链分子的直接前体（Straus ，1976）。二聚体复制中间体也是常见的，AAV复制模型与甚至更大的复制中间体相容。 ...
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| Generation of IgG-Fc Glycovariants Using Recombinant Glycosidases and Glycosyltransferases
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Author:
Date:
2016-08-05
[Abstract] The immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable (Fc) domain contains a single, highly conserved asparagine 297 (N297) glycosylation site in the CH2 domain, which is buried within the hydrophobic core of each of the two heavy chains. The biantennary core glycan structure, composed of 2 N-acetylglucosamine (GlcNAc) and 3 mannose residues, can be further decorated with fucose, bisecting GlcNAc and terminal GlcNAc, galactose, and sialic acid. Presence or absence of distinct residues can alter IgG effector functions such as antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) or complement-dependent cytotoxicity (CDC). Here, we provide a protocol for the generation of IgG-Fc de-galactosylated, galactosylated, de-sialylated and sialylated IgG antibodies using recombinant glycosidases and ...
[摘要] 免疫球蛋白G（IgG）片段可结晶（Fc）结构域在CH2结构域中包含单个，高度保守的天冬酰胺297（N297）糖基化位点，其掩埋在两条重链的每一条的疏水核内。由2个N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和3个甘露糖残基组成的双触角核心聚糖结构可以进一步用岩藻糖，二等分GlcNAc和末端GlcNAc，半乳糖和唾液酸装饰。不同残基的存在或不存在可以改变IgG效应子功能，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）或补体依赖性细胞毒性（CDC）。在这里，我们提供使用重组糖苷酶和糖基转移酶产生IgG-Fc去半乳糖基化，半乳糖基化，去唾液酸化和唾液酸化IgG抗体的方案。
[背景] 糖基转移酶用于抗体聚糖修饰的用途允许将糖底物连接到预先存在的聚糖残基上。免疫球蛋白G在其每个CH2结构域中携带单个高度保守的N-糖基化位点（Arnold等人，2007）（图1），允许用糖基转移酶进行位点特异性聚糖修饰。如果抗体的Fab结构域含有Asn-X-Ser/Thr（X≠Pro）序列（Mellquist等人，1998），则抗体可携带额外的N-聚糖。因此，仔细选择缺少Fab糖基化的单克隆抗体对于Fc特异性聚糖修饰是重要的。本文所述的方案是基于以下出版物开发的（Kingston，2003; Kaneko等人，2006; Anthony等人，2008; Barb等人。，2009; Quast ...
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