| Flow Cytometric Quantification of Fatty Acid Uptake by Mycobacterium tuberculosis in Macrophages
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Author:
Date:
2018-02-20
[Abstract] Mycobacterium tuberculosis (Mtb) has evolved to assimilate fatty acids from its host. However, until recently, there was no reliable way to quantify fatty acid uptake by the bacteria during host cell infection. Here we describe a new method to quantify fatty acid uptake by intracellular bacilli. We infect macrophages with Mtb constitutively expressing mCherry and then metabolically label them with Bodipy-palmitate. Following the labeling procedure, we isolate Mtb-containing phagosomes on a sucrose cushion and disrupt the phagosomes with detergent. After extensive washes, the isolated bacteria are analyzed by flow cytometry to determine the level of Bodipy-palmitate signal associated with the bacteria. Using a Mtb mutant strain defective in fatty acid uptake in liquid culture we ...
[摘要] 结核分枝杆菌（Mtb）已经发展为从其宿主吸收脂肪酸。然而，直到最近，还没有可靠的方法来量化宿主细胞感染期间细菌对脂肪酸的摄取。在这里，我们描述了一种新的方法来量化细胞内杆菌对脂肪酸的摄取。我们用Mtb组成性表达mCherry感染巨噬细胞，然后用Bodipy-palmitate代谢标记它们。标记程序后，我们在蔗糖垫上分离含有Mtb的吞噬体，并用去污剂破坏吞噬体。大量洗涤后，通过流式细胞术分析分离的细菌以确定与细菌相关的Bodipy-棕榈酸酯信号的水平。使用液体培养物中脂肪酸摄取缺陷的Mtb突变株，我们确定该突变体在巨噬细胞感染期间同化比野生型菌株少10倍的Bodipy-棕榈酸酯。脂肪酸摄取的这种定量方法可用于进一步鉴定参与细胞内Mtb和可能的其他细菌的脂质摄取的途径。
【背景】结核分枝杆菌（Mtb）同化宿主来源的脂质（脂肪酸和胆固醇）的能力使得病原体能够在其宿主内存活（Russell等人，2010; Lovewell 等人，2016）。在小鼠感染期间和在人肺组织中，通过巨噬细胞内的Mtb上调胆固醇和脂肪酸代谢相关基因来支持该想法（Schnappinger等人，2003; Rachman等人，2006; Rohde等人，2007;Fontán等人，2008; Tailleux等人，2008; Homolka et al。，2010; Rohde et ...
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| Secretion of Adipsin as an Assay to Measure Flux from the Endoplasmic Reticulum (ER)
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] In this protocol we describe a quantitative biochemical assay to assess the efficiency of endoplasmic reticulum (ER) to Golgi protein transport in adipocytes (Bruno et al., 2016). The assay takes advantage of the fact that adipocytes secrete various bioactive proteins, known as adipokines. As a measure of ER to Golgi flux we determine the rate of bulk secretion of the adipokine adipsin post washout of Brefeldin A (BFA) treatment using immunoblotting. Because BFA treatment results in an accumulation of adipsin in the ER, the exit of adipsin from the ER upon BFA washout is synchronized across cells and experimental conditions. Thus, using this simple assay one can robustly determine if perturbations, such as knocking down a protein, have an effect on ER to Golgi protein transport.
[摘要] 在该方案中，我们描述了一种定量生化测定法来评估内质网（ER）对脂肪细胞中高尔基体蛋白质转运的效率（Bruno等，2016）。 该测定法利用脂肪细胞分泌各种生物活性蛋白质（称为脂肪因子）的事实。 作为对高尔基体通量的ER的测量，我们使用免疫印迹法确定了使用Brefeldin A（BFA）处理的脂肪因子adipsin后消失的体积分泌速率。 因为BFA治疗导致ER中Adipsin的积累，所以在BFA洗脱时，Adipsin从ER的出口在细胞和实验条件下同步。 因此，使用这种简单的测定法可以稳健地确定扰动，如敲低蛋白质，是否对高尔基蛋白转运的ER有影响。
【背景】新合成的蛋白质通过分泌途径从细胞分泌到细胞膜（PM）中。分泌路线包括从ER到高尔基体的运输，穿过高尔基体堆叠，以及从高尔基网络（TGN）到PM的运动。这些运输步骤中的每一个提供用于调节分泌物的节点。虽然大多数细胞能够分泌蛋白质，但某些特定的细胞类型是特异性蛋白质的专业秘密。脂肪细胞，例如，分泌激素，称为脂肪因子，影响各种器官的能量代谢。为了更好地了解脂肪因子分泌的分子基础，我们开发了一种测定方法，研究了从ER到脂肪细胞的高尔基体的脂肪因子，一种脂肪因子的转运。研究ER到高尔基体运输的传统和常用的方法是监测从ER融合到GFP（VSVG-GFP）的温度敏感性水泡性口炎病毒G蛋白ts045的出口（Presley等，1997）。使用adipsin分泌测定法研究脂肪细胞中的高铁运输的优点是监测来自ER的内源性蛋白质的通量，而不是异位表达的报道蛋白。 ...
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| Rapid Determination of Cellulose, Neutral Sugars, and Uronic Acids from Plant Cell Walls by One-step Two-step Hydrolysis and HPAEC-PAD
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2016-10-20
[Abstract] The plant cell wall is primarily composed of the polysaccharides cellulose, hemicellulose and pectin. The structural and compositional complexity of these components are important for determining cell wall function during plant growth. Moreover, cell wall structure defines a number of functional properties of plant-derived biomass, such as rheological properties of foods and feedstock suitability for the production of cellulosic biofuels. A typical characterization of cell wall chemistry in the molecular biology lab consists of a mild acid hydrolysis for the quantification of hemicellulose and pectin-derived monomers and a separate analysis of cellulose by the Updegraff method. We have adopted a streamlined ‘one-step two-step’ hydrolysis protocol that allows for the simultaneous ...
[摘要] 植物细胞壁主要由多糖纤维素，半纤维素和果胶组成。这些组分的结构和组成复杂性对于确定植物生长期间的细胞壁功能是重要的。此外，细胞壁结构限定了植物来源的生物质的多种功能性质，例如食品的流变性质和用于生产纤维素生物燃料的原料适用性。分子生物学实验室中细胞壁化学的典型表征包括用于定量半纤维素和果胶衍生单体的温和酸水解和通过Updegraff方法对纤维素的单独分析。我们采用了一个简化的"一步两步"水解方案，允许通过配对的脉冲安培检测（HPAEC-PAD）的高效阴离子交换层析同时测定纤维素含量，中性糖和糖醛酸样品。在我们的工作中，该方案已经在很大程度上替代了Updegraff纤维素定量和用2μMTFA水解以在微量级上测定基质多糖组成。
[背景] 是基于在121℃下在4％（w/v）硫酸中水解的样品的配对分析。一组样品首先用72％（w/w）硫酸预处理以使纤维素膨胀并使其易于稀释酸水解（图1中的Saeman水解; ...
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