| A Detailed and Radioisotope-free Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)
|
|
Author:
Date:
2020-08-20
[Abstract] To comprehensively characterize the functions of a transcription factor (TF), it is required to analyze the interaction of this TF with its targeted loci. Several methods such as β-glucuronidase (GUS) or luciferase reporter, yeast one-hybrid (Y1H), chromatin-immunoprecipitation (ChIP), and electrophoretic mobility shift assay (EMSA) assays have been developed. Of these, EMSA is an in vitro method which can prove the direct interaction between TF and targeted DNA fragment. In the present protocol, DNA probes are labeled with Biotin. Therefore, it is safer for researchers when they do not need to use radioisotope-labeled probes. In addition, this protocol is to provide a detailed procedure for a successful EMSA assay. The interested recombinant protein can be mixed with ...
[摘要] [摘要] 为了全面表征转录因子（TF）的功能，需要分析该TF与目标基因座的相互作用。已经开发了几种方法，例如β-葡萄糖醛酸苷酶（GUS）或荧光素酶报道基因，酵母单杂交（Y1H），染色质免疫沉淀（ChIP ）和电泳迁移率变动分析（EMSA）分析。其中，EMSA是体外的 可以证明TF与目标DNA片段之间直接相互作用的方法。在本协议中，DNA探针用生物素标记。因此，当研究人员不需要使用放射性同位素标记的探针时，它更安全。此外，该协议还将为成功的EMSA分析提供详细的程序。可以将感兴趣的重组蛋白与靶向DNA探针混合，以在室温（25°C）下进行结合反应。之后，反应混合物可以在天然聚丙烯酰胺凝胶中运行，并转移到带正电的尼龙膜上。最后，可以通过生物素-链霉亲和素化学发光检测结果并可视化。
[背景 ] EMSA是检测蛋白（之间的直接相互作用的有效方法例如，转录因子）和DNA片段（陈，2011）。通常，与蛋白质结合的DNA探针的移动速度比凝胶中的游离DNA探针的移动速度慢。可以观察到这种蛋白质-DNA复合物的移动带移位，而游离DNA探针向凝胶底部的移动速度更快。基于此特征，可以用放射性同位素[ 例如Phosphorus-32（32 ...
|
|
|
| The RiboPuromycylation Method (RPM): an Immunofluorescence Technique to Map Translation Sites at the Sub-cellular Level
|
|
Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] While isotopic labeling of amino acids remains the reference method in the field for quantifying translation rate, it does not provide any information on spatial localization of translation sites. The rationale behind developing the ribopuromycylation method (RPM) was primarily to map translation sites at the sub-cellular level while avoiding detection of newly synthesized proteins released from ribosomes. RPM visualizes actively translating ribosomes in cells via standard immunofluorescence microscopy in fixed and permeabilized cells using a puromycin-specific monoclonal antibody to detect puromycylated nascent chains trapped on ribosomes treated with a chain elongation inhibitor.
[摘要] 尽管氨基酸的同位素标记仍然是用于定量翻译速率的领域中的参考方法，但是其不提供关于翻译位点的空间定位的任何信息。 开发ribopuromycylation方法（RPM）的基本原理主要是在亚细胞水平上绘制翻译位点，同时避免检测从核糖体释放的新合成的蛋白质。 RPM通过使用嘌呤霉素特异性单克隆抗体的固定的和透化的细胞中的标准免疫荧光显微镜可视化主动翻译细胞中的核糖体以检测捕获在用链延长抑制剂处理的核糖体上的嘌呤化新生链。
【背景】几十年来，氨基酸的同位素标记被认为是研究蛋白质翻译的金标准。虽然这种方法已被证明是非常准确的评估翻译率，它没有提供翻译核糖体的位置信息。最近，氨基酸类似物使荧光检测新生链（Dieterich等人，2007）。然而，几乎所有检测到的信号都来自核糖体释放的多肽。我们最初的想法是开发一种方法来标记新生链，同时还束缚于翻译核糖体。
嘌呤霉素（PMY）是一种氨基糖苷类抗生素，模拟带电荷的tRNA Tyr并掺入核糖体A位点。因此，PMY通过核糖体催化 - ...
|
|
|
| Determining Ribosome Translational Status by Ribo-ELISA
|
|
Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] The Ribo-ELISA was originally developed to elucidate the basis for the ribopuromycylation method (RPM)-based detection of ribosome bound nascent chains. The Ribo-ELISA enables characterization of the translational status of ribosomes, and can be applied to the discovery of super-ribosomal complexes with novel ribosome associated macromolecules that are isolated by physical fractionation in sucrose gradients or other methods.
[摘要] Ribo-ELISA最初是为阐明基于核糖核苷酸化方法（RPM）的核糖体结合新生链检测的基础而开发的。 Ribo-ELISA能够表征核糖体的翻译状态，并且可以应用于通过蔗糖梯度中的物理分离或其他方法分离的新型核糖体相关大分子的超核糖体复合物的发现。
【背景】核糖体是由40S和60S亚单位组成的异构结构，当多个核糖体与单个mRNA结合时，它们以单体和多核糖体存在于细胞中。 另外，翻译核糖体可以与调节翻译的多个分子复合物相关联。 核糖体ELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）能够通过核糖体相关新生链的体外嘌呤化检测翻译核糖体（David等人，2012）。 在将嘌呤霉素添加至具有结合的新生链的核糖体时，这种化学反应自发进行。 该方法定量测定每个核糖体中出现的新生链的数量，并且可以用于确定单核细胞相对于多核糖体的翻译状态，并鉴定结合其他大分子的核糖体，其改变其在沉淀柱中的沉降速率或迁移。
|
|
|