| Endogenous C-terminal Tagging by CRISPR/Cas9 in Trypanosoma cruzi
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] To achieve the C-terminal tagging of endogenous proteins in T. cruzi we use the Cas9/pTREX-n vector (Lander et al., 2015) to insert a specific tag sequence (3xHA or 3xc-Myc) at the 3’ end of a specific gene of interest (GOI). Chimeric sgRNA targeting the 3’ end of the GOI is PCR-amplified and cloned into Cas9/pTREX-n vector. Then a DNA donor molecule to induce DNA repair by homologous recombination is amplified. This donor sequence contains the tag sequence and a marker for antibiotic resistance, plus 100 bp homology arms corresponding to regions located right upstream of the stop codon and downstream of the Cas9 target site at the GOI locus. Vectors pMOTag23M (Oberholzer et al., 2006) or pMOHX1Tag4H (Lander et al., 2016b) are used as PCR templates for ...
[摘要] 为了实现克氏锥虫内源蛋白的C末端标记，我们使用Cas9 / pTREX-n载体（Lander等，2015）在3'末端插入特异性标签序列（3xHA或3xc-Myc）特定的感兴趣基因（GOI）。将靶向GOI 3'末端的嵌合sgRNA进行PCR扩增，并克隆到Cas9 / pTREX-n载体中。然后扩增通过同源重组诱导DNA修复的DNA供体分子。该供体序列包含标签序列和抗生素抗性标记，加上对应于位于终止密码子右上游的区域和在GOI基因座的Cas9靶位点下游的100bp同源臂。载体pMOTag23M（Oberholzer等，2006）或pMOHX1Tag4H（Lander等，2016b）用作DNA供体扩增的PCR模板。用sgRNA / Cas9 / pTREX-n构建体和DNA供体盒共转染的Epimastigotes然后用抗生素培养5周以选择双重抗性寄生虫。最终通过PCR和Western印迹分析验证了内源基因标记。
【背景】自从CRISPR / ...
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| Multiplexed GuideRNA-expression to Efficiently Mutagenize Multiple Loci in Arabidopsis by CRISPR-Cas9
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Author:
Date:
2017-03-05
[Abstract] Since the discovery of the CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-associated protein (Cas) as an efficient tool for genome editing in plants (Li et al., 2013; Shan et al., 2013; Nekrasov et al., 2013), a large variety of applications, such as gene knock-out, knock-in or transcriptional regulation, has been published. So far, the generation of multiple mutants in plants involved tedious crossing or mutagenesis followed by time-consuming screening of huge populations and the use of the Cas9-system appeared a promising method to overcome these issues. We designed a binary vector that combines both the coding sequence of the codon optimized Streptococcus pyogenes Cas9 nuclease under the control of the Arabidopsis thaliana ...
[摘要] 自从发现CRISPR（聚集的定期交织的短回文重复） - 相关蛋白（Cas）作为植物基因组编辑的有效工具（Li等人，2013; Shan等人已经出版了诸如基因敲除，敲入或转录调控等各种各样的应用，例如，2013; Nekrasov等人，2013）。到目前为止，植物中多种突变体的产生涉及繁琐的杂交或诱变，随后大量人群的耗时筛选，Cas9系统的使用似乎是有希望的方法来克服这些问题。我们设计了一种二元载体，其结合了在拟南芥UBIQUITIN10（UBQ10）启动子和引导RNA（gRNA）控制下的优化的化脓性链球菌（Caspase）密码子的编码序列）由 A驱动的表现盒。拟南芥U6 - 启动子，用于在拟南芥中进行有效的多重编辑（阎等人，2016年）。在这里，我们描述了一个逐步的方案，以经济有效的方式生成含有多个gRNA的二元载体和基于经典克隆方法的Cas9核酸酶。背景 RNA引导的Cas9系统源于针对外源DNA的细菌防御系统（Sorek等人，2013）。由于其高效率，易于处理和多重编辑的可能性，已经被认为是基因组编辑的选择方法。通常，Cas9基因编辑系统涉及单个合成RNA分子，其指导Cas9蛋白质靶向所需DNA位点以进行基因组修饰或转录控制的gRNA。 gRNA-Cas9复合物通过gRNA-DNA配对识别靶向的DNA，并需要存在原始相邻基序（PAM）。 ...
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| Single-step Marker Switching in Schizosaccharomyces pombe Using a Lithium Acetate Transformation Protocol
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Author:
Date:
2016-12-20
[Abstract] The ability to utilize different selectable markers for tagging or mutating multiple genes in Schizosaccharomyces pombe is hampered by the historical use of only two selectable markers, ura4+ and kanMX6; the latter conferring resistance to the antibiotic G418 (geneticin). More markers have been described recently, but introducing these into yeast cells often requires strain construction from scratch. To overcome this problem we and other groups have created transformation cassettes with flanking homologies to ura4+ and kanMX6 which enable an efficient and time-saving way to exchange markers in existing mutated or tagged fission yeast strains.
Here, we present a protocol for single-step marker switching by ...
[摘要] 利用不同的选择标记来标记或突变粟酒裂殖酵母中的多个基因的能力受到仅仅两种可选择标记的历史使用的阻碍，即 +和 kanMX6 ;后者赋予抗生素G418（遗传霉素）抗性。最近已经描述了更多的标记物，但是将它们引入酵母细胞通常需要从头开始施加应变。为了克服这个问题，我们和其他团队已经创建了具有与 + 和 kanMX6 的侧翼同源性的转换盒，这使得能够有效和省时的方式在现有的突变或标记的裂变酵母菌株中交换标记。
＆nbsp;在这里，我们提出了裂殖酵母，粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中醋酸锌转化的单步标记转换方案。以下我们将介绍如何将 ura4 + 标记交换到kanMX6 ， natMX4 或 hphMX4标记，其分别对抗生素G418，海参（clonNAT）或潮霉素B提供抗性。我们还详细介绍了如何交换营养标记的任何 MX 标记，例如 arg3 + ， his3 + ， leu1 + 和 ura4 + 。
背景 这种用于粟酒裂殖酵母的单步骤标记交换方案允许将标记有类型的抗生素标记的任何标记或突变的基因替换为营养标记物（含有arg3 + ， + ，并且已经构建了 ura4 + ）并且为任何 MX交换遗传 ura4 + ...
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