| Chase Assay of Protein Stability in Haloferax volcanii
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Author:
Date:
2017-03-20
[Abstract] Highly regulated and targeted protein degradation plays a fundamental role in almost all cellular processes. Determination of the protein half-life by the chase assay serves as a powerful and popular strategy to compare the protein stability and study proteolysis pathways in cells. Here, we describe a chase assay in Haloferax volcanii, a halophilic archaeon as the model organism.
[摘要] 高度调节和靶向的蛋白质降解在几乎所有的细胞过程中发挥重要作用。通过追踪测定法测定蛋白质半衰期是比较蛋白质稳定性和研究细胞中蛋白水解途径的有力和普遍的策略。在这里，我们描述了作为模型生物体的嗜盐古细菌Haloferax volcanii 中的追踪测定。
背景 在真核生物中，泛素蛋白酶体系统在高选择性和靶向性蛋白水解中起主要作用（Glickman and Ciechanover，2002）。最近的证据表明，小型古细菌泛素样修饰蛋白或SAMPs也起到了蛋白酶体破坏的靶向蛋白的作用（Maupin-Furlow，2014; Anjum等人，2015; Fu et al。 。，2016）。体内蛋白质半衰期的测量提供了研究蛋白水解途径的直接途径。环己酰胺追踪和脉冲追踪测定通常用于监测真核生物中靶向蛋白质的降解（Zhou，2004）。前一种方法用于确定放线菌酮抑制平移伸长后所有细胞蛋白的半衰期;而脉冲追踪测定法测量新合成（脉冲标记）蛋白质的周转率，而不干扰正常的细胞生长。与真核系统相比，确定古细菌中一种给定蛋白质半衰期的快速简便方法尚未明确。因此，我们开发了一种方案，用于测量盐爱好的考古Haloferax volcanii的体内蛋白质稳定性。使用翻译抑制剂（茴香霉素）和转录（放线菌素D）来最小化该古细菌中新蛋白质的合成。 ...
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| An HPLC-based Method to Quantify Coronatine Production by Bacteria
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Date:
2017-03-05
[Abstract] Coronatine is a polyketide phytotoxin produced by several pathovars of the plant pathogenic bacterium Pseudomonas syringae. It is one of the most important virulence factors determining the success of bacterial pathogenesis in the plant at both epiphytic and endophytic stages of the disease cycle. This protocol describes an optimized procedure to culture bacterial cells for coronatine production and to quantify the amount of coronatine secreted in the culture medium using an HPLC-based method.
[摘要] 冠心病是由植物病原菌的几种病原体产生的聚酮化合物植物毒素。它是在疾病周期的附生和内生期阶段确定植物细菌发病机制成功的最重要的毒力因素之一。该方案描述了用于培养用于冠状病毒产生的细菌细胞的优化方法，并且使用基于HPLC的方法定量培养基中分泌的冠状动脉的量。
背景 Coronatine（COR）是有效的细菌植物毒素，是植物激素茉莉酮酸-L异亮氨酸（JA-Ile）的分子模拟物。因此，COR激活茉莉酸（JA）信号传导，诱导JA响应基因，并拮抗免疫信号水杨酸的作用。 COR由两种成分组成：冠心病（CFA）和冠状氨酸（CMA）。编码CMA和CFA生物合成的基因在细菌中不是组成型表达的。相反，当细菌在诱导培养基中生长时，这些基因在植物叶片表面或植物体内或/或体外诱导（Palmer和Bender，1993; Panchal等等，2016）。本文介绍了从Panchal等人改编的方法。 （2016），以确定细菌产生冠心病的能力，可用作毒性指征。
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| Sequencing of Ebola Virus Genomes Using Nanopore Technology
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Author:
Date:
2016-11-05
[Abstract] Sequencing of virus genomes during disease outbreaks can provide valuable information for diagnostics, epidemiology, and evaluation of potential countermeasures. However, particularly in remote areas logistical and technical challenges can be significant. Nanopore sequencing provides an alternative to classical Sanger and next-generation sequencing methods, and was successfully used under outbreak conditions (Hoenen et al., 2016; Quick et al., 2016). Here we describe a protocol used for sequencing of Ebola virus under outbreak conditions using Nanopore technology, which we successfully implemented at the CDC/NIH diagnostic laboratory (de Wit et al., 2016) located at the ELWA-3 Ebola virus Treatment Unit in Monrovia, Liberia, during the recent Ebola virus ...
[摘要] 病毒基因组在疾病爆发期间的测序可以为诊断，流行病学和潜在对策的评估提供有价值的信息。然而，特别是在偏远地区，后勤和技术挑战可能很大。纳米孔测序提供了经典的Sanger和下一代测序方法的替代物，并且在爆发条件下成功使用（Hoenen等人，2016; Quick等人，2016 ）。在这里我们描述了用于在爆发条件下使用纳米孔技术对埃博拉病毒进行测序的方案，我们在CDC/NIH诊断实验室（de Wit等人，2016）成功地实施了ELWA- 3 确定病毒基因组的全长序列是必不可少的，因为它是在利比里亚蒙罗维亚的埃博拉病毒治疗股在最近在西非爆发的埃博拉病毒爆发期间。
<病毒学中的程序。虽然经典的方法涉及sanger测序后引物步行战略，较新的方法涉及使用下一代测序方法，如454，illumina或ion torrent技术。所有这些技术的常见问题，尽管它们的许多优点，是所需的仪器是大的，昂贵的，脆弱的，因此难以运输。此外，经常涉及文库制备程序。虽然在通常情况下这些问题没有什么影响，因为这些机器在具有优良基础设施的专门实验室中运行，在偏远地区的病毒爆发期间（例如在埃博拉病毒爆发的情况下），这可能造成重大问题，特别是在样品出口从受影响的地区到这些专门的实验室往往在政治和后勤方面具有挑战性。在这些情况下，可以容易和快速地部署到偏远地区，并允许在爆发区域直接进行测序的测序技术的可用性是非常有价值的。因此，我们已经在monrovia的elwa-3埃博拉病毒治疗单元的现场诊断实验室测试了minion测序装置，该装置当时正在由oxford="" nanopore="" technologies（ont）开发。（de="" wit等人，/em="">。，2016），并且制定了在这些条件下快速产生埃博拉病毒的全长序列的方案。该装置使用纳米孔，核苷酸链通过其以受控的方式运输。核苷酸阻断并因此调节流过这些孔的离子流，这取决于通过纳米孔的核苷酸的物理性质，并且这些电流调节通过装置测量并翻译成核苷酸序列。该测试的结果表明该技术确实显示出作为可快速部署和高度可用的测序平台的巨大前景，其在其他地方是可用的（Hoenen等人，2016），以及类似的使用与Quick自己的努力独立地执行的相同测序平台进行的测试。 （2016年）。
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