| Image-Based Analysis of Mitochondrial Area and Counting from Adult Mouse Dopaminergic Neurites
|
|
Author:
Date:
2018-08-20
[Abstract] Mitochondria form dynamic cytoplasmic networks which undergo morphological changes in order to adapt to cellular stresses and signals. These changes can include alterations in size and number within a given cell. Analysis of the whole network can be a useful metric to assess overall mitochondrial health, particularly in neurons, which are highly sensitive to mitochondrial dysfunction. Here we describe a method which combines immunofluorescence and computerized image analysis to measure mitochondrial morphology (quantification of number, density, and area) in dopaminergic neurites of mice expressing mitochondrially-targeted eYFP.
[摘要] 线粒体形成动态细胞质网络，其经历形态变化以适应细胞应激和信号。 这些变化可以包括给定单元内的大小和数量的改变。 分析整个网络可以是评估整体线粒体健康的有用指标，特别是在对线粒体功能障碍高度敏感的神经元中。 在这里，我们描述了一种方法，它结合免疫荧光和计算机图像分析，以测量表达线粒体靶向eYFP的小鼠的多巴胺能神经突的线粒体形态（数量，密度和面积的量化）。
【背景】 线粒体是存在于每个复杂生物的基本上所有细胞中的双膜细胞器。它们的主要功能是提供大部分细胞能量作为ATP，但它们也在细胞凋亡，缓冲细胞内Ca 2 + ，活性氧物质产生和膜电位调节中发挥作用（Neupert和Herrmann， 2007; Hamanaka和Chandel，2010; Shutt和McBride，2013）。
这些细胞器通常被描述为单个“豆状”结构，实际上是动态细胞质网络的组成部分。它们可以经历由膜融合和裂变的动态过程调节的主要形态变化，该过程被认为涉及通过称为线粒体自噬的过程消除功能障碍的细胞器。线粒体网络也可以作为对高细胞能量需求的响应而增加（Sheng，2017; Devine和Kittler，2018）。线粒体网络的形态可以根据不同的应激源而改变，并且存在多种可能的形态，即细胞类型，甚至细胞室依赖性（Picard et al。，2013 ...
|
|
|
| In vitro Explant Cultures to Interrogate Signaling Pathways that Regulate Mouse Lung Development
|
|
Author:
Date:
2018-05-20
[Abstract] Early mouse lung development, including specification of primordia, patterning of early endoderm and determination of regional progenitor cell fates, is tightly regulated. The ability to culture explanted embryonic lung tissue provides a tractable model to study cellular interactions and paracrine factors that regulate these processes. We provide up-to-date protocols for the establishment of this culture model and its application to investigate hedgehog signaling in the developing lung.
[摘要] 早期鼠肺发育，包括原基的规范，早期内胚层的构图和区域祖细胞命运的确定，受到严格的调控。 培养移植胚胎肺组织的能力提供了一种易处理的模型来研究调节这些过程的细胞相互作用和旁分泌因子。 我们提供最新的协议，以建立这种文化模式及其应用来研究肺部发育中的刺猬信号。
【背景】小鼠肺发育起始于前肠前内胚层的内胚层憩室（E9.5），随后关闭近端气管食管中隔以形成不同的气管和食道管（Minoo和King，1994）。原始内胚层管的随后分支通过E12.5产生平面肺结构，随后正交分支产生成熟肺的三维结构特征（Metzger等人，2008）。在E12.5之前分离的肺遗传的平面结构适合于在空气液体界面进行体外培养（Carraro等人，2010; Del Moral和Warburton， 2010）。胚胎肺通过解剖使用立体显微镜在亮场照明下或通过与谱系追踪和荧光报道分子偶联时的荧光照明进行分离。在这里，我们描述了使用Shh Cre / Rosa mTmG报告小鼠，其允许Cre介导的从约E8.75起在前部前肠内胚层内的膜定位的GFP的激活（Montgomery <等人，2007;高斯等人，2009; Yao等人，2017）。因此，肺内胚层通过红色荧光由绿色荧光和周围组织显现，从而允许清晰识别和显微切割包括肺在内的发育内胚层结构，并在体外培养期间成像。
|
|
|
| Mammalian Cell-derived Vesicles for the Isolation of Organelle Specific Transmembrane Proteins to Conduct Single Molecule Studies
|
|
Author:
Date:
2018-05-05
[Abstract] Cell-derived vesicles facilitate the isolation of transmembrane proteins in their physiological membrane maintaining their structural and functional integrity. These vesicles can be generated from different cellular organelles producing, housing, or transporting the proteins. Combined with single-molecule imaging, isolated organelle specific vesicles can be employed to study the trafficking and assembly of the embedded proteins. Here we present a method for organelle specific single molecule imaging via isolation of ER and plasma membrane vesicles from HEK293T cells by employing OptiPrep gradients and nitrogen cavitation. The isolation was validated through Western blotting, and the isolated vesicles were used to perform single molecule studies of oligomeric receptor assembly.
[摘要] 细胞衍生的囊泡促进跨膜蛋白在其生理膜中的分离，从而维持其结构和功能完整性。 这些囊泡可以由产生，容纳或运输蛋白质的不同细胞器产生。 结合单分子成像，可以使用分离的细胞器特异性囊泡来研究嵌入蛋白质的运输和组装。 在这里，我们提出了一种通过使用OptiPrep梯度和氮气穴通过从HEK293T细胞中分离ER和质膜囊泡来进行细胞器特异性单分子成像的方法。 通过Western印迹验证分离，并使用分离的囊泡进行寡聚受体组装的单分子研究。
【背景】大量的跨膜蛋白通过多个亚基的组装形成，导致复杂的寡聚结构，其可以通常以多种化学计量存在。了解组装中的变化如何改变在不同细胞器中的贩运和本地化对于确定蛋白质的生理作用以及与成熟和运输相关的疾病的连接至关重要。单分子方法可以通过直接测量其化学计量比来更好地理解寡聚蛋白的组装（Ulbrich和Isacoff，2007; Richards等人，2012）。这种方法避免了整体平均，从而提供了所有化学计量的平均状态（Walter and Bustamante，2014）。单分子研究近来已被用于理解大分子的结构和功能特性，包括构象动力学（Tan等人，2014），离子通道门控（Wang等人 ，2016），配体 - 受体相互作用（Moonschi等人，2015）和化学计量组装（Ulbrich和Isacoff，2007; ...
|
|
|